宮頸癌組織和Hela細(xì)胞中miR-664的表達(dá)及其對(duì)順鉑化療敏感性的影響

魏茜雪，秦雪，陳青青，嚴(yán)麗梅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦科，遼寧 沈陽(yáng)110004）

已有研究表明，miRNA可能通過調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)宮頸癌的發(fā)生、生長(zhǎng)和進(jìn)展的各個(gè)階段［1］。在眾多調(diào)節(jié)癌癥的miRNA中，miR-664涉及癌細(xì)胞發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、分化和癌細(xì)胞凋亡的許多方面。肝細(xì)胞癌中的miR-664上調(diào)，下調(diào)miR-664能抑制肝癌生長(zhǎng)［2］。在乳頭狀甲狀腺癌和散發(fā)性乳腺癌中miR-664顯著下調(diào)，但其功能作用尚不清楚［3］。本研究擬探討miR-664在宮頸癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平及對(duì)順鉑化療敏感性的影響及其機(jī)制，為宮頸癌的診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2011年5月至2014年7月在我院婦科行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)的宮頸癌患者142例，年齡為40～74歲，平均（57.5±17.8）歲，病程為9個(gè)月～4年，其中絕經(jīng)后患者79例，平均絕經(jīng)年限8年。142例中，鱗癌82例、腺癌60例；人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）陽(yáng)性114例。所有患者行輔助檢查：血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、宮頸病理組織檢查。病理分期采用TNM分期（AJCC癌癥分期手冊(cè)）。所有病例均符合美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)（NCCN）公布的2012版宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。將手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查以判定臨床病理學(xué)特征。同時(shí)取距宮頸癌組織3 cm以上的宮頸組織作為癌旁組織?；颊呔栽柑峁┱m頸組織及宮頸癌組織標(biāo)本進(jìn)行miR-664表達(dá)的檢測(cè)。

1.2 細(xì)胞株、主要儀器與試劑

Hela-229細(xì)胞（上海栩冉生物科技有限公司），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Invitrogen），胰酶（美國(guó)Gibco公司），四甲基偶氮唑藍(lán)（北京廣源恒信科技發(fā)展有限公司），miR-664擬似物（上海伯豪生物技術(shù)有限公司），吖啶橙（碧云天生物技術(shù)公司），胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司），Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），二甲基亞砜（99.9%，美國(guó)Sigma公司），Transcriptor first strand cDNA synthesis kit（日本TaKaRa公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)熱電公司），One Step PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒（日本TaKaRa公司），SYBR Premix Ex Taq II（日本TaKaRa公司），NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測(cè)儀（美國(guó)Thermo公司），BD BiocoatTMMatrigelTM基質(zhì)（上海偉進(jìn)生物科技有限公司），聚碳酸酯孔濾膜（上海正晃商貿(mào)有限公司），Caspase-3、Caspase-9濃度檢測(cè)ELISA試劑盒（上海伯豪生物技術(shù)有限公司），MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)宮頸癌組織及癌旁組織miR-664的表達(dá)

采用Trizol試劑從宮頸癌組織和癌旁組織中提取總RNA。使用One Step PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用SYBR Premix Ex Taq II進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。使用內(nèi)源性U6小核RNA（U6）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（U6正向引物，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； 反 向，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）。通 過2-ΔΔCT方 法 計(jì) 算miR-664相對(duì)表達(dá)水平。PCR引物序列：miR-664正向引物，5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，反向引物，5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′。反應(yīng)體系：正向引物10μL、反向引物10μL、RNA模版0.6μL、超級(jí)酶混合物0.2μL、qRT-PCR緩沖液5 μL、去RNA水3.4μL。循環(huán)如下：95℃持續(xù)10 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，60℃持續(xù)15 s。根據(jù)miR-664表達(dá)水平，≤0.95為陰性，＞0.95為陽(yáng)性［5］。

1.4 細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)及Hela-229細(xì)胞miR-664擬似物轉(zhuǎn)染

將宮頸癌Hela-229細(xì)胞株加入到含1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640中，置于37℃、5%CO2、20%O2培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)，用0.5%胰蛋白酶消化傳代。

將10 mL Hela-229癌細(xì)胞液接種于6孔板，取100 pmol的miR-664擬似物加入到200μL DMEM培養(yǎng)基中，另外取4μL Lipofectamine2000加入，混勻lipofectamine2000和miRNA 液，室溫培育30 min，將混合液加入6孔板中，無菌PBS洗滌細(xì)胞，6 h后棄混合液，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.5 細(xì)胞分組

將Hela-229細(xì)胞分為3組。對(duì)照組：取10 mL（5×106）Hela-229細(xì)胞液加入到含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、20% O2）；順鉑組：在與對(duì)照組相同量培養(yǎng)液與細(xì)胞液中，加入順鉑（5μmol／L）5 mL；順鉑+轉(zhuǎn)染組：取10 mL轉(zhuǎn)染miR-664的Hela-229細(xì)胞液，加入順鉑（5μmol／L）5 mL，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2、20% O2）。以上各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣，培養(yǎng)72 h。

1.6 MTT法檢測(cè)Hela-229細(xì)胞活力及癌細(xì)胞單克隆形成數(shù)目檢測(cè)

將各組Hela-229細(xì)胞液接種于6孔板，每孔加入MTT溶液（5 mg／mL）10μL，37℃恒溫箱孵育4 h，加入150μL的二甲基亞砜，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（D）值。將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM（12孔板，1×103細(xì)胞／孔，每孔設(shè)6個(gè)平行樣）。培養(yǎng)5 d后，用亞甲藍(lán)染色細(xì)胞，倒置顯微鏡計(jì)數(shù)成像區(qū)域中的菌落形成數(shù)目（×400）。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hela-229細(xì)胞株凋亡及細(xì)胞周期

將Hela-229細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，通過胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白Ⅴ-FITC和PI溶液在黑暗中染色15 min。最后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。

1.8 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將2 mm厚的Matrigel凝膠（8.2 g／L）均勻平鋪于聚碳酸酯微孔濾膜上，3組Hela-229細(xì)胞液（細(xì)胞密度為5×106／mL）各取60μL加入小室，并加入1 000μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；室溫培育12 h后，使用無菌醫(yī)用棉簽輕微刮除濾膜小室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。高倍鏡下選取中心和四周各5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)穿過8μm微孔的細(xì)胞數(shù)。

1.9 qRT-PCR檢測(cè)Hela-229細(xì)胞miR-664表達(dá)

上述3組Hela-229細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，無菌收集細(xì)胞。取5 mL細(xì)胞液（細(xì)胞密度為5×106／mL），5 000 r／min離心5 min，-70℃凍存?zhèn)溆?。qRTPCR檢測(cè)miR-664表達(dá)水平，方法同“1.3”。

1.10 ELISA 法檢測(cè)Hela-229細(xì)胞培養(yǎng)液中Caspase-3、Caspase-9的濃度

Hela-229細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，5 000 r／min離心收集各組細(xì)胞，加入PBS制成細(xì)胞懸液后，采用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中Caspase-3、Caspase-9的質(zhì)量濃度。具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

采用Epidata、SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中miR-664表達(dá)量

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，宮頸癌組織中miR-664相對(duì)表達(dá)量為0.95±0.38，明顯低于癌旁正常組織（3.53±0.09，t＝78.728，P＜0.01）。

2.2 miR-664表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表1可見，miR-664表達(dá)與年齡相關(guān)性不明顯（P＞0.05）；與TNM分期、病理學(xué)分級(jí)、復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性明顯，且TNM分期越高、病理學(xué)分期越高、有復(fù)發(fā)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-664陽(yáng)性表達(dá)率越低（均P＜0.01）。

2.3 各組Hela-229細(xì)胞miR-664表達(dá)水平比較

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，順鉑組、順鉑+轉(zhuǎn)染組miR-664的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.01），順鉑+轉(zhuǎn)染組miR-664表達(dá)也顯著高于順鉑組（P＜0.01）。見圖1。結(jié)果表明miR-664轉(zhuǎn)染成功，順鉑能誘導(dǎo)miR-664高表達(dá)。

2.4 各組Hela-229細(xì)胞存活率

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，順鉑組、順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率分別為（42.01±8.24）%、（24.36±3.21）%，均明顯低于對(duì)照組［（78.52±8.25）%，F(xiàn)＝19.369，P＜0.01］；而順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率又顯著低于順鉑組（t＝21.159，P＜0.01）。結(jié)果表明，miR-664能抑制Hela細(xì)胞的增殖。

表1 miR-664 RNA表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 各組Hela-229細(xì)胞miR-664表達(dá)量比較

2.5 各組Hela-229細(xì)胞單克隆形成數(shù)目

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑組、順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞單克隆形成數(shù)目均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞單克隆形成數(shù)目又明顯低于順鉑組（P＜0.01）。見圖2。

2.6 各組Hela-229細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，順鉑組、順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組（均P＜0.01），順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率又明顯高于順鉑組（P＜0.01）。見圖3。

圖2 各組Hela-229細(xì)胞單克隆形成數(shù)目

2.7 各組Hela-229細(xì)胞G1期比較

順鉑組、順鉑+轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞比例分別為（55.88±0.95）%、（45.43±0.84）%，均顯著低于對(duì)照組［（67.96±1.06）%，均P＜0.01］；順鉑+轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞比例又顯著低于順鉑組（P＜0.01）。見圖4。

2.8 各組Hela-229細(xì)胞穿膜數(shù)比較

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑組、順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜數(shù)均明顯低于對(duì)照組（均P＜0.01），順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜數(shù)又顯著低于順鉑組（P＜0.01）。見圖5。

2.9 各組Hela-229細(xì)胞培養(yǎng)液Caspase-3、Caspase-9濃度比較

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，順鉑組、順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液中的Caspase-3、Caspase-9質(zhì)量濃度均顯著高于對(duì)照組（均P＜0.01），而順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液Caspase-3、Caspase-9濃度又顯著高于順鉑組（P＜0.01）。見表2。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Hela-229細(xì)胞凋亡率

圖4 各組Hela-229細(xì)胞G1期比較

圖5 各組Hela-229細(xì)胞穿膜數(shù)的比較

表2 各組Hela-229細(xì)胞培養(yǎng)液Caspase-3、Caspase-9濃度n＝6

3 討論

肝癌體外實(shí)驗(yàn)表明，NF-κB p65可直接抑制miR-664的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，進(jìn)而間接抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲［6］。此外，在人乳腺癌細(xì)胞中，miR-664可抑制Raf激酶蛋白（RKIP）轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞的侵襲［7-9］。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織miR-664表達(dá)明顯低于癌旁組織，miR-664與TNM分期、病理學(xué)分級(jí)、復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，且TNM分期越高、病理學(xué)分期越高、有復(fù)發(fā)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例miR-664表達(dá)越低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明miR-664過表達(dá)能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)，這與上述文獻(xiàn)中miR-664抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲相符合。最近的研究表明，miR-664通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制淋巴管生成和血管生成，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用［7］。多項(xiàng)研究顯示，miR-664在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，miR-664低水平表達(dá)與不同癌癥的進(jìn)展相關(guān)［2］。上述結(jié)果提示miR-664在腫瘤進(jìn)展和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，miR-664抑制腸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制與 G1-S相變的加速，p21Cip1 和p27Kip1的下調(diào)以及細(xì)胞周期蛋白D1的上調(diào)有關(guān)［10］。miR-664的低表達(dá)是PI3K／AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞周期進(jìn)展至G1期的必要條件。此外，PI3K／AKT的激活增加p21Cip1和p27Kip1的細(xì)胞水平，并抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖［11］。金屬基質(zhì)酶的失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增加，這是許多腫瘤局部侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。miR-664能抑制金屬基質(zhì)酶活性，表明miR-664在癌癥的生物療法中具有優(yōu)勢(shì)。miR-664抑制癌細(xì)胞侵襲，具有用于癌癥基因治療的潛在優(yōu)勢(shì)，表達(dá)miR-664可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，上調(diào)p53、Fas配體、TNFR1和TNFR2的表達(dá)，促進(jìn)肺癌治療效果［12］。研究表明，miR-664可通過Caspase依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，miR-664的過度表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放并激活Caspase-8和Caspase-9途徑，兩者均導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡［13］。miR-664還可通過Fas相關(guān)依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑［14］。這一事實(shí)表明miR-664可能通過p53途徑間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，順鉑組、順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率、單克隆形成數(shù)目、G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞穿膜數(shù)均明顯低于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Caspase-9濃度顯著高于對(duì)照組；順鉑+轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率、單克隆形成數(shù)目、G1期細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞穿膜數(shù)又顯著低于順鉑組，細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Caspase-9濃度明顯高于順鉑組。該結(jié)果說明miR-664能增強(qiáng)順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的化療敏感性，明顯抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和浸潤(rùn)，其機(jī)制可能與其加速宮頸癌癌細(xì)胞凋亡、G1進(jìn)程以及Caspase-3、Caspase-9過表達(dá)有關(guān)。