馬病毒性動脈炎病毒中和試驗的建立以及與ELISA方法的比較研究

張海明，鄭麗蘭，段曉冬，相文華，沈 丹，薛 紅，梁卓粵，彭南秀，程 忠，彭 聰

（1.廣州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 廣州市動物疫病預防控制中心，廣東廣州 510440；2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150001）

馬病毒性動脈炎（equine viral arteritis，EVA）是由馬動脈炎病毒（equine arteritis virus，EAV）所引起的馬屬動物的一種接觸性傳染性病毒病[1]。該病早先發(fā)現于美國俄亥俄州，并由Doll等人從馬流產胎兒中首次分離出馬動脈炎病毒[2]。目前，馬病毒性動脈炎存在于世界各地的馬群中[3]。該病多呈亞臨床感染，也可引發(fā)不同程度的癥狀，比如發(fā)燒、精神沉郁、食欲減退、四肢以及陰囊和包皮墜性水腫、結膜炎、皮膚麻疹塊和流產等。在幼駒，雖然不多見，但可暴發(fā)肺炎或肺腸炎。除了馬駒之外，其他日齡馬感染后病死率通常都很低，感染馬幾乎毫無例外都能完全臨床康復，但很大一部分種公馬會長期帶毒，而母馬、去勢馬和性未成熟的小馬尚未發(fā)現有帶毒現象。

馬病毒性動脈炎是我國的二類動物疫病，也是全世界各國進出口檢疫非常重視的馬屬動物疫病之一。該病的診斷方法主要有補體結合試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光試驗、瓊擴試驗、病毒中和試驗、聚合酶鏈氏反應技術和病毒分離等。其中，病毒中和試驗由于其敏感性高、特異性強等特點，被公認是馬病毒性動脈炎抗體檢測的“金標準”[4]，同時也是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的馬病毒性動脈炎診斷方法。但是由于ELISA方法具有操作簡單、便于大規(guī)模篩查和靈敏度高等特點，目前已有較多ELISA方法成功建立和應用的報道[5-7]。為了解這兩種方法檢測結果的符合性，筆者建立了馬病毒性動脈炎病毒中和試驗，并與ELISA方法進行比較，以期為我國馬病毒性動脈炎檢測工作特別是廣東從化無規(guī)定馬屬動物疫病區(qū)維護工作中馬病毒性動脈炎檢測方法的選擇提供借鑒。

1 材料

1.1 RK-13細胞系

兔腎細胞（RK-13細胞）系由廣東省出入境檢驗檢疫局惠贈。

1.2 細胞培養(yǎng)用試劑

MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶EDTA購自美國Invitrogen公司。

1.3 病毒和血清

馬病毒性動脈炎病毒標準毒株（Bucyrus株）由廣東省出入境檢驗檢疫局惠贈；標準陽性血清購自美國NVSL；馬病毒性動脈炎標準陰性血清批號為372EDV0201，中等抗體效價標準陽性血清批號為370EDV1101，高抗體效價標準陽性血清批號為999-EOS-EVA；馬鼻肺炎陽性血清、馬傳染性貧血陽性血清和馬流感陽性血清由中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈。

馬血清來自廣東省部分地區(qū)馬場，由本實驗室采集并保存。

1.4 豚鼠補體

豚鼠補體購自美國Rockland公司，批號為22049。

1.5 ELISA試劑盒

馬病毒性動脈炎抗體ELISA商品化試劑盒為西班牙INGENASA公司產品，試劑盒批號為200612。

2 方法

2.1 病毒制備與病毒TCID50的測定

取馬動脈炎病毒標準毒株1 mL接種于剛長滿單層的RK-13細胞上，37 ℃感作1 h后倒去病毒液，再加入含2%胎牛血清的MEM維持液，37 ℃培養(yǎng)30～40 h，每天進行觀察，待大部分細胞出現細胞病變（CPE）時，反復凍融3次后收集培養(yǎng)液，用Reed-Muench法進行病毒TCID50的測定。

2.2 病毒中和試驗操作

將待檢馬血清和標準陰陽性血清于56℃水浴中滅活1 h待用。將待檢馬血清用2%MEM維持液進行1:2和1:4稀釋后加入到滅菌V型96孔板中相應位置中，并設置好血清空白對照。于另一塊滅菌V型96孔板中設標準陽性對照，用2%MEM對馬病毒性動脈炎標準陽性血清從1:2開始進行倍比稀釋。并設立病毒對照。

于所有除血清空白對照外的孔中加入含有10%補體的工作濃度的EAV，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中作用1 h后，將所有液體轉移到已準備好的含有RK-13細胞的細胞板的相應位置中，每天觀察，48 h后讀取結果。

2.3 EVA病毒中和試驗特異性試驗

將馬病毒性動脈炎標準陰陽性血清、馬鼻肺炎陽性血清、馬傳染性貧血陽性血清、馬流感陽性血清用EVA微量血清中和試驗方法進行檢測，每個樣品設3個重復，取平均值比較結果。

2.4 EVA病毒中和試驗重復性試驗

對馬病毒性動脈炎標準陽性血清（高抗體效價和中抗體效價）進行三次EVA病毒中和試驗，記錄檢測得到的抗體效價。

2.5 EVA ELISA操作

按照試劑盒說明書進行操作，血清樣品OD值大于cut off值（陰性血清對照OD450+0.2）的判定為陽性，即樣品中存在馬病毒性動脈炎抗體；否則為陰性。

3 結果

3.1 EAV在接種RK-13細胞約30～40 h即出現50%～75%左右的細胞出現病變，病變以細胞大量呈團狀、拉絲狀聚集，嚴重的出現細胞破碎和脫落。

3.2 根據Reed-Muench法對制備的EAV進行TCID50的測定，該批病毒的TCID50為10-6.5/0.1 mL。

3.3 該中和試驗用EAV標準陰陽性血清作為對照，1:2和1:4稀釋的標準陽性血清能完全中和工作濃度的馬病毒性動脈炎病毒，而1:2和1:4稀釋的標準陰性血清不能中和該病毒。

3.4 用馬傳貧、馬流感和馬鼻肺炎陽性血清進行交叉中和試驗，均不能中和EAV，說明本試驗方法具有較好的特異性。

3.5 用馬病毒性動脈炎標準陽性血清（高抗體效價和中抗體效價）進行三次EVA病毒中和試驗，檢測得到的抗體效價在±1個滴度以內，說明本試驗方法具有較好的重復性。

4 EVA病毒中和試驗的初步應用以及與ELISA方法的比較

4.1 兩種方法的結果

本實驗對189份馬血清分別進行了EVA病毒中和試驗和ELISA的檢測，結果在VNT檢測中，陽性數為7份，陰性數為182份；在ELISA檢測中，陽性數為16份，陰性數為173份，具體見表1。

表 1 馬病毒性動脈炎VNT和ELISA檢測結果

4.2 兩種方法的比較分析

在ELISA檢測的16份陽性血清中，VNT檢測有5份陽性，陽性符合數為5份，陽性符合率為43.48%（5+5/16+7）；陰性符合數為171份，陰性符合率為96.34%（171+171/173+182），總符合率為93.12%（5+171/189），具體見表2、3。

表 2 馬病毒性動脈炎VNT和ELISA檢測結果比較

表 3 馬病毒性動脈炎VNT和ELISA檢測結果符合率

4.3 ELISA的敏感性與特異性

如果將我們建立的馬病毒性動脈炎VNT作為EVA抗體檢測的“金標準”，試驗中所用ELISA的敏感性和特異性分別為71.43%和93.96%。

5 討論

目前，除了對馬精子進行病毒分離外，馬病毒性動脈炎的檢測主要依靠血清學方法。雖然病毒中和試驗是OIE推薦的馬病毒性動脈炎的檢測方法，但由于病毒中和試驗需要較高的實驗條件和操作能力，以及檢測結果的出具需要較長的時間，各種馬病毒性動脈炎抗體ELISA商品化試劑盒應運而生。但是在過去幾年的廣東從化無規(guī)定馬屬動物疫病區(qū)馬病監(jiān)測工作中[8]，我們發(fā)現馬病毒性動脈炎ELISA的檢測結果與VNT的檢測結果存在較大的差異，因此，我們建立了適合本實驗室的馬病毒性動脈炎病毒中和試驗，并與商品化的EVA ELISA試劑盒進行比較。

根據我們的比較結果，ELISA方法能檢出更多的陽性結果，這可能與ELISA方法本身可能產生較多的假陽性有關[9]。另外，EVA VNT檢測到的是中和抗體，而ELISA檢測到的一般情況下是非中和抗體，這也可能是兩者檢測結果不同的原因之一。而對于ELISA無法檢出部分VNT檢測陽性的血清，另一個可能的原因是，對于那些包被GP5蛋白的ELISA方法，目前已發(fā)現有部分EVA毒株編碼GP5的基因發(fā)生一定的改變而導致ELISA無法檢出這些毒株所誘發(fā)的抗體[1]。

我們通過兩種檢測方法的比較和分析發(fā)現，馬病毒性動脈炎VNT和ELISA檢測馬血清的陰性符合率較高，而陽性符合率較低，因此，如果用ELISA作為EVA檢測的篩查甚至替代VNT進行檢測，可能會導致部分陽性血清的漏檢。另外，以我們建立的VNT作為馬病毒性動脈炎抗體檢測的“金標準”，試驗中所用的ELISA方法的敏感性和特異性分別為71.43%和93.96%，與Duthie等[5]的試驗結果一致，說明ELISA方法在檢測馬病毒性動脈炎抗體時，特異性較高，但也存在敏感性不夠的問題。

綜上所述，我們認為在馬病毒性動脈炎抗體檢測中，不能以ELISA替代病毒中和試驗，也不能采用以抗體ELISA進行篩檢然后對陽性樣品用病毒中和試驗進行確診的方法。

致謝：在本實驗完成過程中得到了愛爾蘭馬病中心、廣東省出入境檢驗檢疫中心、山東出入境檢驗檢疫中心等單位的大力支持和幫助，在此表示真誠的感謝。

[1]OIE. Manual of Diagnosis Tests and Vaccines for Terrestrial Animals [M]. Paris：OIE，2008：904-918.

[2]Jones T C，Doll E R，Bryans J T. The lesions of equine viral arteritis [J]. Cornell Vet，1956，47（1）：52-68.

[3]黃從平，梁成珠，朱來華. 馬病毒性動脈炎的研究進展[J].河南畜牧獸醫(yī)，1999，20（5）：25-27.

[4]Cho H J，Entz S C，Deregt D，et al. Detection of antibodies to equine arteritis virus by a monoclonal antibody-based blocking ELISA [J]. Can J Vet Res，2000，64（l）：38-43.

[5]Duthie S，Mills H，Burr P.The efficacy of a commercial ELISA as an alternative to virus neutralisation test for the detection of antibodies to EAV [J]. Equine Vet J，2008，40（2）：182-183.

[6]梁成珠，曹瑞兵，魏建超，等. 馬動脈炎病毒GL 蛋白主要抗原域的表達及間接ELISA 的初步建立[J]. 微生物學報，2006，46（3）：436-440.

[7]彭聰，王奕青，周彩信，等. 廣州亞運無規(guī)定馬屬動物疫病區(qū)建設與探討[J]. 中國動物檢疫，2011，28（8）：9-18.

[8]彭聰，沈丹，彭南秀，等. 廣州亞運無疫區(qū)動物疫病監(jiān)測與凈化[J]. 中國動物檢疫，2012，29（7）：47-52.

[9]Cook R F，Gann S J，Mumford J A. The effects of vaccination with tissue culture-derived viral vaccines on detection of antibodies to equine arteritis virus by enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）[J]. Vet Microbiol，1989，20（2），181-189.