嵌合抗原受體 T細胞治療卵巢癌的抗原靶點研究進展△

李浩蘭，李桐，李文忠，路國秋，王建東

1北京中捭生物科技有限公司，北京100080

2首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京100010

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是致死率最高的婦科惡性腫瘤，由于發(fā)病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，約70%的患者在就診時已屬于晚期[1]，經(jīng)過手術以及化療后仍有超過80%的患者會復發(fā)[2]。尋找新的OC治療方法對于提高患者的生存率具有重要意義。嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）治療技術是新型的抗腫瘤免疫療法，在血液腫瘤治療中取得了很好的效果，但在OC中應用較少，其治療效果和OC的抗原靶點有關。本文回顧和總結CAR-T技術以及卵巢中可應用于CAR-T治療的不同類型的靶點抗原，旨在為卵巢癌CAR-T治療的靶點選擇提供理論支持。

1 CAR-T技術

CAR-T是一種經(jīng)過基因修飾來靶向腫瘤特異性抗原的自體T細胞療法，現(xiàn)已經(jīng)開發(fā)到第四代[3]。第一代嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）結構在2006年首次被構建，其包含細胞外識別腫瘤抗原的單鏈可變區(qū)（single-chain variable fragment，scFv），促進CAR和與靶細胞表面膜近側抗原結合的鉸鏈區(qū)以及細胞內(nèi)的免疫細胞活化序列CD3ζ。第一代CAR-T在OC的Ⅰ期臨床試驗中并未顯示出明顯的抗腫瘤作用[4]，故研究者開始對CAR的結構進行改造以增強CAR-T的抗腫瘤作用。第二代CAR在第一代的基礎上增加了一個細胞內(nèi)共刺激信號元件，如 CD28、CD134、CD137或 CD27[5]。共刺激信號元件的加入顯著延長了CAR-T在體內(nèi)的存活時間并增強了其抗腫瘤作用，首次用于B細胞淋巴瘤治療也展示出了良好的抗腫瘤效果[6]。第三代CAR則包含兩個及以上的共刺激信號元件，旨在提高轉基因的表達，促進CAR-T的激活和擴增，在體內(nèi)試驗中包含CD28和CD137兩個共刺激元件的第三代CAR-T顯示出更強的抗腫瘤活性[7]。第四代CAR則加入了細胞因子來增強CART殺傷腫瘤細胞的效果[8]。經(jīng)過十多年的發(fā)展，CAR結構基本明確：包含細胞外特異性識別腫瘤抗原的scFv片段、促進與腫瘤表面膜近側抗原結合的鉸鏈區(qū)、固定CAR的跨膜區(qū)、增強T細胞活化的共刺激元件和T細胞活化信號轉導CD3ζ鏈[9]。當靶細胞上的抗原與CAR上的受體結構域結合時，通過鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)將信號傳遞至細胞內(nèi)，細胞內(nèi)信號域?qū)⑿盘栟D化為活化信號，激活效應細胞進行增殖，產(chǎn)生細胞因子和穿孔素等殺傷靶細胞[10]。目前多采用第二代（單共刺激信號元件）和第三代（雙共刺激信號元件）CAR進行臨床試驗。（圖1）

圖1 四代CAR的結構示意圖

CAR-T療法已經(jīng)在血液腫瘤治療中取得了突破性成就。第一個靶向CD19的CAR-T藥物CTL019用于治療兒童及年輕成人復發(fā)性/難治性急性淋巴細胞白血病，3個月完全緩解率可達83%[11]，并于2017年8月獲得美國食品藥品管理局（FDA）批準上市。此外，另一藥物YESCARTA在治療大B細胞淋巴瘤時完全緩解率可達51%[12]，并最終于2017年10月獲得FDA批準上市，成為首款針對特定非霍奇金淋巴瘤的CAR-T治療藥物。CAR-T在實體瘤的治療中也展現(xiàn)出了巨大的潛力。2016年12月，希望之城（Hope of City）研究中心利用靶向白細胞介素-3 受體 α2（interleukin-3 receptor α2，IL-3Rα2）的CAR-T治療復發(fā)性多灶膠質(zhì)母細胞瘤，10次腦室注射治療后，患者腫瘤病灶完全消失且未出現(xiàn)強烈的不良反應[13]。2017年7月賓夕法尼亞大學關于靶向表皮生長因子受體Ⅲ型突變體（epidermal growth factor receptor variantⅢ，EGFRVⅢ）陽性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的CAR-TⅠ期臨床試驗結果表明，CAR-T能夠成功穿越血腦屏障，在腫瘤位點發(fā)現(xiàn)了CAR-T的浸潤[14]。此外，針對肺癌、結直腸癌、胰腺癌等腫瘤均已開展靶向特異性腫瘤抗原的CAR-T療法[15-17]。

2 CAR- T治療OC的抗原靶點

目前CAR-T療法面臨的主要挑戰(zhàn)是臨床安全性，因此選擇合適的靶點對于CAR-T療法的安全性和有效性至關重要。理想的腫瘤靶點應該在惡性腫瘤組織中表達而在正常組織中不表達，因為即使在正常組織中只有低劑量的表達也會導致急性和嚴重的脫靶毒性[18-20]。目前國內(nèi)針對OC的CAR-T治療的研究很少，但國際上一些著名研究機構如紀念斯隆凱瑟琳癌癥中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，MSKCC）和賓夕法尼亞大學等已經(jīng)開展了關于OC的CAR-T治療研究（表1）[1,4,15,21-27]。

2.1 人表皮生長因子受體（human epithelial growth factor receptor 2，HER 2）

HER2為人表皮生長因子受體家族的成員之一，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體樣蛋白，分子量為185 kD，由與配體結合的胞外區(qū)、信號轉導的跨膜區(qū)和具有激酶活性的胞內(nèi)區(qū)組成[1]。HER2能夠抑制細胞凋亡，誘導新生血管生成，提高細胞運動能力從而促進腫瘤的生長增殖和浸潤轉移[28]。HER2在正常組織如胃腸道、呼吸道、尿道、皮膚、乳腺和胎盤中均有不同程度的表達[29]。研究表明，在2%～66%的OC組織中能夠檢測到HER2的過表達[30]，因此HER2可作為OC CAR-T治療中的特異性靶點。晚期OC患者通常高表達HER2，并且患者體內(nèi)可以檢測到CD4+和CD8+T細胞的響應[31]。目前針對OC的CAR-T研究已完成臨床前體外實驗，可證明HER2-CAR-T能夠識別并殺傷表達HER2的OC細胞，而對HER2表達陰性的細胞不產(chǎn)生響應[32]，現(xiàn)已有兩項Ⅰ期臨床試驗正在進行中。

2.2 間皮素（mesothelin，MSLN ）

MSLN是一種糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定蛋白，分子量為69 kD，蛋白酶加工后形成一個40 kD的膜結合蛋白和一個31 kD稱之為巨核細胞促進因子的脫落片段并釋放至細胞外[33]。MSLN能夠通過影響絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路參與調(diào)節(jié)細胞的凋亡，同時還參與信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路來影響細胞的增殖，進而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[34]。MSLN一般限制性地表達于胸膜、腹膜、心包的漿膜細胞及氣管、卵巢、扁桃體、輸卵管的間皮細胞上。研究證明，MSLN表達于多種實體瘤中，其中約70%的OC組織中存在MSLN的表達[35]，因此MSLN可作為OC CAR-T治療的潛在靶點。臨床前實驗結果表明，人源化MSLN-CAR-T在體外與MSLN陽性細胞共培養(yǎng)時能夠產(chǎn)生炎性因子并有效裂解靶細胞，體內(nèi)回輸OC細胞移植小鼠模型表現(xiàn)出一定的抗腫瘤效應[21]，同時并未出現(xiàn)脫靶毒性。目前已有兩個靶向MSLN的CAR-T臨床試驗分別在美國（已完成）和中國展開（正在招募中）。

表1 CAR-T療法靶向特異性腫瘤抗原治療OC的試驗總結

2.3 葉酸受體 α（folate receptor α，F(xiàn)R α）

FRα是由GPI錨定的一個38 kD的蛋白，介導葉酸的攝入、細胞增殖、氨基酸代謝、DNA和RNA的合成及甲基化等過程[30]。FRα在腎、胃、肺等正常組織的上皮細胞腔面上有微弱的表達，在多種腫瘤組織如OC、子宮內(nèi)膜癌、非小細胞肺癌、結腸癌、乳腺癌中過表達。其中超過90%的OC組織高表達FRα，表達水平比正常卵巢組織，高90倍[36]。此外，考慮到FRα的生物學功能，F(xiàn)Rα的CAR-T治療將會是相對安全和易耐受的，這使得FRα成為OC CAR-T治療的理想靶點。臨床前實驗結果證明，加入共刺激元件CD27的第二代FRα-CAR-T展示出了有效的裂解OC細胞的能力[4]。目前針對FRα-CAR-T治療的Ⅰ期臨床試驗已完成。

2.4 黏蛋白 16（mucin 16，MUC16）

MUC16是一種高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，由60個重復序列的156個氨基酸的胞外段、跨膜段和32個氨基酸的胞內(nèi)段組成。MUC16參與調(diào)節(jié)細胞的代謝和增殖過程[37]。MUC16能夠抑制自然殺傷（natural killer，NK）細胞的激活從而阻止NK細胞與腫瘤細胞結合，NK細胞也能夠與MSLN結合，提高細胞黏附性，同時MUC16還可以與細胞質(zhì)內(nèi)JAK激酶2（Janus kinase 2，JAK2）結合上調(diào)細胞周期蛋白D1（cyclin D1）和胚胎干細胞多能性維持關鍵基因（Nanog homeobox，NANOG）的表達，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[38]。MUC16在正常組織中幾乎不表達，而在超過80%的OC細胞中高表達，另外在子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結腸癌、乳腺癌和肺癌細胞中也有過表達[39]。MUC16在腫瘤細胞中存在剪切機制，胞外段糖類抗原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）經(jīng)剪切后被釋放，并可在血漿中被檢測到。CA125作為OC免疫標志物檢測中的重要參考指標，超過90%的OC患者血清中CA125的表達上調(diào)，而術后患者體內(nèi)CA125高表達者復發(fā)率高達85%～93%[40]。因此MUC16同樣可作為OC CAR-T治療的理想靶點。MSKCC針對MUC16開發(fā)的單靶點CAR-T在臨床前研究中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效果，現(xiàn)正開展Ⅰ期臨床研究[22]。

2.5 紐約食管鱗狀細胞癌 1（New York esophageal 1，NY-ESO- 1）

NY-ESO-1屬于癌-睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）家族，分子量為18 kD，N端含有甘氨酸富集區(qū)，C端為一個疏水氨基酸尾，NY-ESO-1的作用機制尚不清楚[41]。作為CTA，NY-ESO-1在正常組織中僅限制性地表達于睪丸和胚胎組織，但是在多種腫瘤組織，如OC、神經(jīng)母細胞瘤、黑色素瘤等中均有高表達[42]。此外，由于血睪屏障的存在，正常組織并不會發(fā)生免疫毒性，因此NY-ESO-1是OC CAR-T治療的理想靶點。研究發(fā)現(xiàn)，約43%的OC腫瘤組織中高表達NY-ESO-1，并且能夠?qū)YESO-1多肽發(fā)生響應從而產(chǎn)生CD8+T細胞[43]，并且這種CD8+T細胞能夠在71%的OC患者的腫瘤浸潤淋巴細胞和腫瘤相關淋巴細胞中檢測到[44]。目前針對NY-ESO-1的CAR-T治療在OC中未開展相關研究，但對于多發(fā)性骨髓瘤治療已完成臨床前階段，第二代NY-ESO-1-CAR-T細胞在體外培養(yǎng)過程中能夠釋放炎性因子并有效裂解靶細胞，同時也能夠發(fā)揮明顯的體內(nèi)抗腫瘤作用[23]。目前針對表達NY-ESO-1的OC的臨床試驗多采用T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）療法，且未見不良反應[45]。這為NY-ESO-1的CAR-T治療的安全性奠定了基礎。

2.6 卵泡刺激激素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）

FSHR是由寡聚糖蛋白構成的七次跨膜受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，由695個氨基酸組成[46]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR能夠通過與卵泡刺激素結合來調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育，并在腫瘤血管形成中發(fā)揮作用[47]。FSHR僅在睪丸支持細胞和卵巢粒層細胞中表達，而在其他正常組織中不表達。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR在33%的透明細胞性OC、67%的黏液性OC和70%的子宮內(nèi)膜癌中均存在高表達[48]，因此，F(xiàn)SHR可作為OC CAR-T治療的潛在靶點。目前針對OC靶向FSHR的CAR-T治療已經(jīng)完成了臨床前試驗，結果顯示FSHR-CAR-T細胞能夠特異性殺傷表達FSHR的OC細胞，同時在體內(nèi)試驗時表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效果，顯著地提高小鼠的生存率，并且沒有觀察到不良反應[24]。

2.7 其他抗原

除了上文提到的一些抗原，還有其他一些潛在靶點，如自然殺傷細胞2族成員D配體（natural killer group 2 member D ligand，NKG2DL）、CD133、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、腎母細胞瘤1（Wilms tumor 1，WT1）等，在OC中也呈現(xiàn)較高的表達水平。

NKG2DL廣泛表達于OC組織中[49]。目前針對OC的NKG2DL-CAR-T治療已經(jīng)完成臨床前試驗，NKG2DL-CAR-T細胞能夠有效殺傷表達NKG2DL的OC細胞[25]。Ⅰ期臨床試驗已經(jīng)展開。

CD133為一個干細胞標志物抗原，在約31%的OC組織中有表達[50]。臨床前實驗中，CD133-CART細胞能夠有效發(fā)揮抑制OC移植瘤小鼠腫瘤生長的作用[26]，靶向CD133治療OC的CAR-T治療也已經(jīng)開展。

EGFR和HER2同屬于人表皮生長因子受體家族的成員，能夠促進腫瘤血管的生成。EGFR在35%～70%的OC中有表達[51]。臨床前試驗表明EFGRCAR-T細胞能夠有效殺傷表達EGFR的非小細胞肺癌細胞[15]，針對高表達EGFR的OC的CAR-T臨床試驗也在進行中。

WT1能夠促進腫瘤的浸潤和轉移，在超過50%的OC和子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)高表達，且WT1高表達的腫瘤患者通常預后較差[30]。目前以WT1為靶點的OC治療已經(jīng)展開了TCR治療研究[27]，這為WT1的CAR-T治療奠定了基礎。

3 小結與展望

CAR-T療法經(jīng)過近幾年爆炸式的發(fā)展，已經(jīng)成功應用于血液病以及部分實體腫瘤的治療，并與“免疫檢查點阻斷抗體療法”一起被評為“2013年度十大科學突破”之首[52]。目前針對OC的CAR-T療法在臨床前試驗和臨床試驗中均表現(xiàn)出較好的治療效果，但也存在著一些限制。首先，臨床上，CART回輸后可能引起包括脫靶效應、細胞因子釋放綜合征、發(fā)熱反應等不良反應，因此選擇合適的靶點抗原能夠有效避免脫靶效應，使CAR-T發(fā)揮最大作用。此外，由于高度異質(zhì)化的實體腫瘤不會均一地表達單一靶抗原，且單一靶點的CAR-T治療往往會誘發(fā)對應靶抗原的丟失，使得單一靶點的CAR-T不能有效識別和殺傷腫瘤細胞，從而限制其治療效果。目前已有研究組織利用雙靶點技術同時靶向多個抗原[53-54]，這樣能夠有效避免抗原的逃逸，也提高了CAR-T治療的安全性。其次，腫瘤微環(huán)境中存在的免疫負調(diào)控機制會抑制腫瘤微環(huán)境內(nèi)T細胞的抗腫瘤免疫反應，導致T細胞耗竭，影響CAR-T的治療效果。目前已有多個研究組織和機構將CART技術同免疫檢查點抑制劑聯(lián)用，一方面解除T細胞的免疫抑制狀態(tài)，一方面增強T細胞對腫瘤細胞的攻擊力，從而對OC發(fā)揮更強的療效。

將CAR-T技術應用到OC的治療中，并通過選擇合適的抗原、雙靶點技術和同免疫檢查點抑制劑聯(lián)用等方法解除CAR-T技術在OC臨床治療中的限制，不僅能夠豐富現(xiàn)有有限的治療手段，同時有望突破OC復發(fā)率高、效果不佳的困境，達到“根治”的效果，從而使更多的患者從中受益。