響應(yīng)曲面優(yōu)化超聲波輔助提取無(wú)花果葉總黃酮的工藝研究

蘇適，王雙俠

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

無(wú)花果葉是?？浦参餆o(wú)花果（Ficus caricaL.）的葉片，我國(guó)擁有極為豐富的無(wú)花果種植資源，分布在我國(guó)中部、西北部、南部省份，有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。無(wú)花果葉中含有黃酮、糖類、果膠、單寧、維生素C 及微量元素等化學(xué)成分[1-2]。臨床研究表明，無(wú)花果葉提取物具有抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抑菌和降血糖等作用[3-5]。無(wú)花果葉中含有大量的黃酮類化合物，黃酮具有很多藥理作用，能預(yù)防心血管疾病、抗骨質(zhì)疏松、治療腹瀉、清除氧化自由基、降血脂、治療咽喉腫痛和調(diào)節(jié)免疫等作用[6-8]。

目前提取黃酮常用的傳統(tǒng)提取方法有醇提法、雙水相提取法、水蒸汽蒸餾法等[9-11]，成本低、便于操作，但費(fèi)時(shí)、提取率偏低。近年來(lái)超聲提取法在中草藥的提取中應(yīng)用較多，此法利用超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，破壞植物組織，加強(qiáng)總黃酮的溶出和擴(kuò)散，將植物中的化學(xué)成分快速提取出來(lái)，從而提高產(chǎn)物的提取率[12]。與常規(guī)溶劑提取法相比，超聲輔助提取方法具有操作簡(jiǎn)單方便、效率高，溶劑使用量少，耗時(shí)短，提取液雜質(zhì)少等特點(diǎn)，已廣泛用于天然植物有效成分的提取。因此，本試驗(yàn)利用超聲輔助法對(duì)無(wú)花果葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化法確定最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)花果葉：市售，制成粗粉。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁（分析純）：國(guó)藥試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

KQ-50B 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；101C-2B 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；XV-9200 紫外分光光度計(jì)：北京市精密儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無(wú)花果葉總黃銅的提取工藝流程

無(wú)花果葉粉末→粉碎（過(guò)40 目篩）→乙醇浸泡→超聲輔助提取→提取液→濃縮→干燥→無(wú)花果葉總黃酮提取物。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取蘆丁對(duì)照品10.0 mg，加乙醇溶解并定容，配制成濃度為0.10 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[13]，用紫外分光光度法在波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定梯度濃度溶液的吸光度，得到無(wú)花果葉總黃酮的線性回歸方程為：Y=0.012x-0.009，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 3，由數(shù)據(jù)可分析得出標(biāo)準(zhǔn)品具有良好的線性關(guān)系。

1.3.3 提取率計(jì)算

取單因素試驗(yàn)項(xiàng)下及響應(yīng)面試驗(yàn)項(xiàng)下的提取物，加乙醇溶解，并定容至50 mL 于容量瓶中，按1.3.2 項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，并根據(jù)回歸方程，計(jì)算無(wú)花果葉總黃酮濃度，進(jìn)而計(jì)算提取率。

式中：C為測(cè)得濃度；V為定容體積；F為稀釋倍數(shù)；M為原料質(zhì)量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

稱取無(wú)花果葉粗粉，采用超聲法：輔助提取總黃酮，各單因素變量分別設(shè)置為：超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）；超聲功率（100、200、300、400、500 W）；乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、30%、40%、50%、60%）；料液比[1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）]，分析各因素對(duì)提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取液料比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率4 個(gè)影響顯著的因素，根據(jù)Box-Behnken Design 中心組合設(shè)計(jì)原理，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化提取條件，因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of response surface experiments

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin7.5 和Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)提取的影響

超聲時(shí)間對(duì)無(wú)花果葉中總黃酮的提取率影響如圖1所示。

由圖1可知，總黃酮提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，在40 min 時(shí)達(dá)到最大值。分析原因可能是隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波產(chǎn)生的空化作用和機(jī)械震動(dòng)的持續(xù)作用下，加速無(wú)花果葉中黃酮向溶劑中溶出。但隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，總黃酮的提取率呈下降趨勢(shì)，在溶劑中超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使組織中大量細(xì)胞破裂，部分黃酮發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞，同時(shí)也會(huì)增加部分雜質(zhì)的溶出[14]，最后造成總黃酮總提取率下降。因此，超聲時(shí)間選擇30 min～50 min 進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.2 超聲功率對(duì)提取率的影響

超聲功率對(duì)無(wú)花果葉中總黃酮的提取率影響如圖2所示。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoids

圖2 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of total flavonoids

由圖2可知。黃酮類物質(zhì)的提取率隨著超聲強(qiáng)度的增大而提高，其原因是超聲強(qiáng)度越大，超聲波所產(chǎn)生的破碎效應(yīng)和熱效應(yīng)越明顯，能夠促使細(xì)胞壁破裂，無(wú)花果葉胞內(nèi)的黃酮類物質(zhì)的溶出加速。但超聲強(qiáng)度達(dá)到400 W 后，繼續(xù)增大超聲功率黃酮類物質(zhì)的提取率反而逐漸減少，其原因可能是超聲強(qiáng)度過(guò)高，超聲波的機(jī)械作用增強(qiáng)，產(chǎn)生的熱量過(guò)多，造成某些黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞[15]，致使總黃酮提取率下降。因此，超聲功率選擇200 W～400 W 進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)無(wú)花果葉中總黃酮的提取率影響如圖3所示。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

由圖3可知，提取率隨著乙醇濃度的增加而增加，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%后，再增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取率反而下降，可能是乙醇濃度不斷增大會(huì)使脂溶雜質(zhì)、色素和糖類等物質(zhì)大量溶出，而影響黃酮類化合物的溶出，使黃酮類化合物的提取率降低[16]。因此，乙醇濃度為30%～50%進(jìn)行Box-Behnke 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.4 料液比對(duì)提取率的影響

料液比對(duì)無(wú)花果葉中總黃酮的提取率影響如圖4所示。

圖4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖4可知，提取率隨著提取溶劑的量的增多而呈上升趨勢(shì)，但料液比大于1∶60（g/mL）時(shí)總黃酮的提取率出現(xiàn)下降?？赡苁菬o(wú)花果葉粉末在溶液中的分散程度也增大，接觸面積增大，有利于黃酮的提取；但當(dāng)料液比超過(guò)1∶60（g/mL）時(shí)因?yàn)榇罅咳軇┯脮?huì)吸收一定的超聲波產(chǎn)，增加了超聲波破碎細(xì)胞的阻力，降低了細(xì)胞的破碎程度；也可能是因?yàn)槿軇w積過(guò)大時(shí)傳質(zhì)過(guò)程受到影響，導(dǎo)致提取率下降[17]。因此，料液比選擇1∶50（g/mL）～1∶70（g/mL）進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 2 Response surface test design scheme

2.2.2 響應(yīng)面的建立與分析

采用Design-Expert8.0.6 軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)分析，得到二次回歸擬合方程Y=3.48+0.13A-2.5×10-4B+0.18C+1.750×10-3D+0.025AB-0.076AC+0.052AD-0.024BC-0.057BD+0.041CD-0.27A2+1.967×10-3B2-0.34C2-0.23D2

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

續(xù)表3 方差分析表Continue table 3 Variance analysis table

由表3可知，P＜0.000 1，說(shuō)明回歸模型方程極顯著，即建立的模型有意義；失擬值P=0.320 5＞0.05，沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明回歸方程與試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差??；確定系數(shù)R2=0.981 3，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.962 6，說(shuō)明模型方程與試驗(yàn)擬合程度好，可用此模型對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取條件進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)?；貧w方程各項(xiàng)方差分析表明，回歸模型一次項(xiàng)A、C為模型極顯著因素，二次項(xiàng)A2、C2和D2為模型極顯著因素，交互項(xiàng)AC為模型顯著因素，其余各項(xiàng)對(duì)無(wú)花果葉總黃酮得率影響均不明顯。各因素對(duì)提取率的影響作用：C＞A＞D＞B。

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面圖可以顯著反映各因素之間相互作用的強(qiáng)弱，采用Box-Behnken 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

響應(yīng)曲面越陡峭，則表明該因素對(duì)總黃酮得率的影響越大，響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)矫舾?，反之，曲面越平緩則影響越?。坏雀呔€能反映各因素間交互作用強(qiáng)弱，橢圓形說(shuō)明兩因素交互作用顯著，而圓形則反之。由圖可知，超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)曲線陡峭，說(shuō)明二者相互作用對(duì)總黃酮提取率的影響極顯著；超聲時(shí)間與料液比的交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響不顯著，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值無(wú)顯著性變化。等高線圖中，其線性呈橢圓或趨向橢圓，表明對(duì)總黃酮提取得率影響顯著，呈圓形則不顯著。

圖5 各因素交互作用對(duì)無(wú)花果葉總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on total flavonoids yield of ficus carica leaves

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)，分析回歸模型，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，最終得出該提取方法是準(zhǔn)確可靠。無(wú)花果葉總黃酮的最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)43.85%、超聲時(shí)間41.8 min、料液比1∶60.85（g/mL）、超聲功率200 W，理論預(yù)計(jì)值3.522%。結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際情況，最終選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)43%、超聲時(shí)間42 min、料液比1∶60（g/mL）、超聲功率200 W，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得到總黃酮提取率平均值為3.519%，與預(yù)測(cè)值接近，驗(yàn)證了此模型的有效性，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型與實(shí)際情況擬合較好。

3 結(jié)論

根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化無(wú)花果葉總黃酮提取條件，得出超聲波輔助法提取總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)43%、超聲時(shí)間42 min、料液比1∶60（g/mL）、超聲功率200 W，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，在此條件下無(wú)花果葉總黃酮的提取率可達(dá)3.519%。與傳統(tǒng)提取工藝相比，該提取工藝時(shí)間短，提高了總黃酮得率，為無(wú)花果葉的開(kāi)發(fā)及利用提供了理論依據(jù)。