沙棘甾醇化合物的分離純化研究

龔晨，高慶超，常應(yīng)九，王悅，王樹林，2，*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016；2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810016）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）為胡頹子科沙棘屬，包括柳葉沙棘、中國沙棘、中亞沙棘等。主要分布于我國青海、新疆等，種植面積占全世界的90%[1]。沙棘具有多種生物活性成分，如維生素C、黃酮、植物甾醇等。其中植物甾醇主要有β-谷甾醇、豆甾醇等，具有乳化性和穩(wěn)定性，并能明顯地降低體內(nèi)膽固醇水平[2]，對腫瘤的生長和癌細(xì)胞的擴(kuò)散具有一定的抑制效果[3]。此外，還可促進(jìn)機(jī)體對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，并具有較強(qiáng)的抗氧化作用，已運(yùn)用于醫(yī)藥、化妝品、食品、光學(xué)產(chǎn)品、植物基因工程等相關(guān)領(lǐng)域[4]。

目前國內(nèi)外對植物甾醇提取分離的方法有皂化法、酯化法、溶劑結(jié)晶法、酶法和沸石吸附法等[5-6]。其中，最常用的方法是溶劑結(jié)晶法。該法可制備出高純度的產(chǎn)品，且具有簡便的工藝流程，適合工業(yè)化的連續(xù)生產(chǎn)。確定規(guī)?；a(chǎn)前的工藝數(shù)據(jù)，是β-谷甾醇生產(chǎn)工藝研究的關(guān)鍵內(nèi)容[7]。植物甾醇的純化主要采用大孔樹脂吸附法、分子蒸餾法、超臨界CO2萃取法等[8-9]。由于大孔吸附樹脂有較高的穩(wěn)定性、較好的吸附選擇性、較溫和的解吸條件、較長的使用周期等特點(diǎn)，因而具有較好的純化效果。植物甾醇的鑒定方法主要有反式高效液相色譜法、紅外光譜法、薄層色譜法和氣相色譜法等[10]。其中，薄層色譜法快捷簡便、成本低，適合用作混合物中主要成分的快速分離與鑒定。

本試驗(yàn)采用皂化法通過單因素和正交試驗(yàn)確定制備β-谷甾醇粗制品的最佳工藝參數(shù)；利用重結(jié)晶法和大孔吸附樹脂法對甾醇粗制品進(jìn)行精制和純化，并用薄層色譜法進(jìn)行鑒定，以便提高β-谷甾醇的純度。該研究結(jié)果可為今后沙棘中生物活性成分（β-谷甾醇）的理論研究、產(chǎn)品開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AL204 萬分之一分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHSJ-4A 型pH 計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司。

沙棘籽油：青海清華博眾生物技術(shù)有限公司；β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（98%）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；AB-8 大孔樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司；無水乙醇（AR）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；三氯化鐵（AR）：昌邑宏達(dá)化工有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將20 mg β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mL 無水乙醇中，配制成2 mg/mL β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時(shí)稀釋10 倍，分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 的200 μg/mL β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，均以無水乙醇定容至4 mL，加入硫磷鐵顯色劑2 mL，振蕩搖勻，室溫下靜置15 min 后進(jìn)行全波長掃描，并在最大吸收波長處測定吸光值。以β-谷甾醇溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 β-谷甾醇含量的的測定

將供試甾醇樣品配制成濃度為0.04 mg/mL 的溶液。按照1.2.1 中的操作方法，于最大吸收波長處測定其吸光值，并計(jì)算β-谷甾醇含量[11]，公式如下：

β-谷甾醇百分含量/%=（W×V×T）/M×100

式中：W為吸光值對應(yīng)的樣品中β-谷甾醇的濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；T為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，mg。

1.2.3 β-谷甾醇的鑒定

參照文獻(xiàn)并稍作修改[12-14]，采用薄層色譜法進(jìn)行鑒定。以石油醚∶乙醚=8∶2（體積比）的混合液為展開劑，10%的硫酸-無水乙醇溶液為顯色劑，計(jì)算比移值，以鑒定混合物中的甾醇種類。

參照公式：Rf=A/B

式中：A為原點(diǎn)至斑點(diǎn)的距離，cm；B為原點(diǎn)至溶劑前沿的距離，cm。

1.2.4 沙棘甾醇分離純化工藝

沙棘籽油→皂化→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→乙酸乙酯萃取→水洗至中性→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→干燥→甾醇粗制品→重結(jié)晶→甾醇精制品→大孔樹脂吸附→薄層色譜鑒定

準(zhǔn)確稱取2.0 g 沙棘籽油于100 mL 具塞三角瓶中，按照比例加入50%KOH-無水乙醇混合液，置于恒溫振蕩器中皂化，震蕩結(jié)束后，立即將皂化液放入冰水浴中冷卻。加入90 mL 蒸餾水，用30 mL 乙酸乙酯萃取3 次，合并上清液，再用蒸餾水洗滌至中性。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至體積約30 mL 后，烘干稱重，即為甾醇粗制品，并計(jì)算其得率（得率/%=甾醇粗制品質(zhì)量/原料油質(zhì)量×100）。

取一定量甾醇粗制品，加熱溶于適當(dāng)體積的無水乙醇，置于4 ℃冰箱內(nèi)養(yǎng)晶一段時(shí)間后，減壓抽濾，收集濾紙上的晶體，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去母液中的部分乙醇后，再次將其放置冰箱中繼續(xù)養(yǎng)晶，一定時(shí)間后再次抽濾；重復(fù)3 次上述步驟。收集不同結(jié)晶時(shí)間得到的晶體，即為甾醇精制品，測定其中β-谷甾醇的含量。

利用大孔樹脂吸附法，將吸附液上樣并靜置數(shù)小時(shí)后，加入解吸液進(jìn)行洗脫，收集具有相同時(shí)間間隔的流出液，并將其烘干稱重，測定其中β-谷甾醇的含量。并將純化前后的β-谷甾醇分別進(jìn)行薄層色譜鑒定。

1.2.4.1 β-谷甾醇粗制品制備的單因素試驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果[15]，考察50%KOH-無水乙醇溶劑配比為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15（體積比）；料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）；皂化時(shí)間為1、2、3、4 h；皂化溫度為70、80、90、95 ℃對 β-谷甾醇粗制品得率的影響。

1.2.4.2 β-谷甾醇粗制品制備的正交試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[15]及單因素試驗(yàn)結(jié)果，正交試驗(yàn)考察的因素為溶劑配比、料液比、皂化溫度、皂化時(shí)間，指標(biāo)為甾醇粗制品得率，按照正交表L9（34）設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal experiment

1.2.4.3 重結(jié)晶次數(shù)對β-谷甾醇純度的影響試驗(yàn)

稱重干燥后的甾醇粗制品，按料液比為1∶15（g/mL）的比例加入無水乙醇加熱至溶解，放置于冰箱4 ℃下養(yǎng)晶24 h，減壓抽濾后，收集濾紙上的晶體，并用旋蒸儀使濾出母液的體積濃縮至原體積的1/2 并放置在4 ℃的冰箱中，養(yǎng)晶24 h 后再次減壓抽濾；重復(fù)上述步驟3 次。將收集的晶體干燥保存，分別測定其中β-谷甾醇的含量。

1.2.4.4 β-谷甾醇的純化及鑒定

采用大孔吸附樹脂法，參考文獻(xiàn)并作修改[16]。本試驗(yàn)選用AB-8 大孔吸附樹脂，將晶體配制成0.10 mg/mL的吸附液；解吸液按照95%乙醇∶三氯甲烷=1∶5（體積比）進(jìn)行配制。將吸附液上樣4 h 后，加入解吸液進(jìn)行洗脫，每隔15 min 分別對流出液進(jìn)行收集，將收集液放置于60 ℃的烘箱中使溶劑全部蒸發(fā)后稱重，再用無水乙醇配制成0.1 mg/mL 的待測液，測定其吸光值，計(jì)算β-谷甾醇的含量。

將純化前后的β-谷甾醇分別利用薄層色譜法對混合物中甾醇的種類進(jìn)行定性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS2.0 軟件和Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 β-谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

對β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描，確定其最大波長為442 nm（如圖1所示）。以β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.229x+0.032（R2=0.998 8），其中y 為吸光值A(chǔ)；x 為β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（如圖2）。

圖1 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的全波長掃描圖Fig.1 Scanning diagram of full wavelength of β-sitosterol sample

圖2 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of β-sitosterol

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 溶劑配比對甾醇粗制品得率的影響

溶劑配比對甾醇粗制品得率的影響見圖3。

圖3 溶劑配比對甾醇粗制品得率的影響Fig.3 Effects of solvent ratio on the yield of sterol crude products

由圖3可以看出，溶劑50%KOH-無水乙醇配比為1∶10（體積比）時(shí)，甾醇粗制品得率達(dá)到最大，隨溶劑配比進(jìn)一步增大，得率有小幅度下降。原因是當(dāng)溶劑配比較低時(shí)，皂化不夠充分，導(dǎo)致得率較低；溶劑配比過高時(shí)，增加了水洗難度[10]。所以溶劑配比1∶10（體積比）為最佳。

2.2.2 料液比對甾醇粗制品得率的影響

料液比對甾醇粗制品得率的影響見圖4。

圖4 料液比對甾醇粗制品得率的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on the yield of sterol crude products

由圖4可知，當(dāng)料液比1∶15（g/mL）時(shí)，甾醇粗制品得率最高。這是由于料液比較低時(shí)，提取不夠充分，導(dǎo)致得率較低；料液比較高時(shí)，水洗過程中KOH 與甾醇分離不完全，同時(shí)也增加了試劑用量的需求和后期濃縮的難度[10]。所以料液比1∶15（g/mL）最為合適。

2.2.3 皂化時(shí)間對甾醇粗制品得率的影響

皂化時(shí)間對甾醇粗制品得率的影響見圖5。

圖5 皂化時(shí)間對甾醇粗制品得率的影響Fig.5 Effects of saponification time on the yield of sterol crude products

由圖5可知，隨皂化時(shí)間的延長，甾醇粗制品得率呈現(xiàn)先增后降的趨勢。最佳皂化時(shí)間確定為2 h。皂化時(shí)間過短，導(dǎo)致皂化不完全。皂化時(shí)間過長，不易萃取分離，且會(huì)增加生產(chǎn)成本，降低生產(chǎn)效率。因此，最佳皂化時(shí)間為2 h。

2.2.4 皂化溫度對甾醇粗制品得率的影響

皂化溫度對甾醇粗制品得率的影響見圖6。

由圖6可知，甾醇粗制品得率由于皂化溫度不同，呈現(xiàn)一定幅度的變化，且最適皂化溫度為90 ℃。隨皂化溫度上升，得率下降，原因是溫度升高可加速溶質(zhì)的擴(kuò)散和溶劑的滲透，使β-谷甾醇不斷溶出；但溫度過高會(huì)加快雜質(zhì)的溶出，影響β-谷甾醇粗制品得率。所以最佳皂化溫度為90 ℃。

圖6 皂化溫度對甾醇粗制品得率的影響Fig.6 Effects of saponification temperature on the yield of sterol crude products

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以溶劑配比、液料比、皂化溫度、皂化時(shí)間為考察因素，以甾醇粗制品得率為評價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化甾醇粗制品提取工藝，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Results and scheme of orthogonal experiment

根據(jù)表2，由極差分析可知，對β-谷甾醇粗制品得率產(chǎn)生影響的的主次因素：溶劑配比＞料液比＞皂化溫度＞皂化時(shí)間。優(yōu)選組合為A3B3C2D1，即溶劑配比1∶12.5（體積比）、料液比1∶17.5（g/mL）、皂化溫度90 ℃、皂化時(shí)間1.5 h。在此條件下甾醇粗制品的得率為（2.41±0.18）%。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，按照最佳工藝條件制得的晶體中，β-谷甾醇的含量達(dá)到（91.41±0.21）%。

2.4 重結(jié)晶次數(shù)對β-谷甾醇純度的影響結(jié)果

重結(jié)晶次數(shù)對β-谷甾醇純度的影響結(jié)果見圖7。

由圖7可知，樣品中β-谷甾醇純度隨重結(jié)晶次數(shù)增加而下降，第一次結(jié)晶得到的晶體中，β-谷甾醇含量為（91.41±0.75）%；第二次得到的晶體中，β-谷甾醇的含量為（72.81±0.12）%，第三次得到的晶體中，β-谷甾醇的含量為（56.03±1.39）%。

圖7 重結(jié)晶次數(shù)對β-谷甾醇純度的影響Fig.7 Influence of recrystallization number on the purity of βsitosterol

2.5 大孔吸附樹脂純化結(jié)果

洗脫時(shí)間對β-谷甾醇純度影響的結(jié)果見圖8

圖8 洗脫時(shí)間對β-谷甾醇純度的影響Fig.8 Influence of elution time on the purity of β-sitosterol

由圖8可知，用解吸液進(jìn)行洗脫時(shí)，隨時(shí)間的延長，β-谷甾醇的純度呈現(xiàn)先上升后下降的走勢。在46 min～60 min 的時(shí)間段內(nèi)，收集液中β-谷甾醇含量的含量最高，干制后產(chǎn)品中β-谷甾醇含量為（93.54±0.18）%；在46 min～90 min 內(nèi)，β-谷甾醇百分含量均在92%以上，達(dá)到了一定的純化效果。

2.6 薄層色譜鑒定結(jié)果與分析

對純化后的沙棘β-谷甾醇的采用薄層色譜進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見圖9。

圖9 薄層色譜鑒定圖Fig.9 Chart of TLC identification

由圖9可知，純化前后的樣品中都只有一種組分，且該組分與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品有相同的比移值（Rf=0.29±0.01），因此，可以推斷該混合物的組分為β-谷甾醇。

3 討論

在試驗(yàn)中，采用皂化法提取沙棘籽油中甾醇化合物，通過單因素試驗(yàn)與正交優(yōu)化設(shè)計(jì)確定了提取最佳工藝條件為：溶劑50%KOH-無水乙醇配比1∶12.5（體積比）、料液比1∶17.5（g/mL）、皂化溫度90 ℃、皂化時(shí)間1.5 h。在此條件下甾醇粗制品得率為2.41%。這為今后沙棘籽油中甾醇成分的研究提供參考。由于皂化法的弊端，使得沙棘籽油在經(jīng)過皂化完成后無法再次利用，因此，優(yōu)化或開發(fā)新的甾醇提取分離方法將是今后的一個(gè)研究重點(diǎn)與難點(diǎn)。

由圖7可知，重結(jié)晶過程中，β-谷甾醇純度可達(dá)（91.41±0.75）%，這是由于溫度降低時(shí)，β-谷甾醇的溶解度急劇下降，而其他種類甾醇的溶解度變化不明顯[17]，從而達(dá)到精制效果。許文林等[18]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)晶時(shí)間20 h 時(shí)，β-谷甾醇純度最高，與本試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。

由圖8可知，隨著洗脫時(shí)間的延長，β-谷甾醇純度先上升后下降。原因是在開始洗脫時(shí)，由于β-谷甾醇未完全溶解到解吸液中，導(dǎo)致初始階段的收集液中β-谷甾醇濃度偏低[19]；在46 min～90 min 時(shí)，β-谷甾醇純度達(dá)到92%以上。這將為今后沙棘功能活性成分（β-谷甾醇）高附加值產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

皂化法制備甾醇粗制品的最佳工藝條件為：料液比1∶17.5（g/mL）、溶劑50 % KOH：無水乙醇配比1∶12.5（體積比）、皂化時(shí)間1.5 h、皂化溫度90 ℃，得率為2.41%。通過重結(jié)晶法精制，β-谷甾醇純度可達(dá)91.41 %。利用大孔吸附樹脂法純化時(shí)，洗脫時(shí)間在46 min～60 min 內(nèi)，β-谷甾醇純度達(dá)到93.54%，經(jīng)薄層色譜法鑒定，純化后的沙棘甾醇為β-谷甾醇。