微波-超聲輔助聯(lián)合提取銀杏葉中總黃酮的工藝研究

馮靖，彭效明，*，李翠清，*，王騰，居瑞軍，邱曉，陳亮

（1.北京石油化工學(xué)院，燃料清潔化及高效催化減排技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)化工國家級(jí)示范中心，北京102617；2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京100176）

銀杏樹是東亞國家的經(jīng)濟(jì)樹種，又名白果樹。我國是銀杏樹的故鄉(xiāng)，占有全世界銀杏樹總量的70%以上，銀杏樹的葉、根、果均可作藥用，其中銀杏葉的藥用價(jià)值最為突出，這主要是由于銀杏葉中含有豐富的黃酮類化合物，黃酮類化合物是具有色酮環(huán)為基礎(chǔ)的一類化合物，其藥理作用有抗氧化、抗菌、抗腫瘤以及對(duì)心腦血管的保護(hù)作用等，近年來得到廣泛的應(yīng)用和認(rèn)可。銀杏葉在我國已經(jīng)有60 多年的藥用歷史，可見其藥用價(jià)值之可觀，同時(shí)也是近10年來學(xué)術(shù)界研究的重點(diǎn)和焦點(diǎn)。因此縮短試驗(yàn)時(shí)間，提高黃酮類化合物的提取量有著非常重要的意義[1-5]。

本文利用超聲-微波輔助聯(lián)合提取法與醇提法來提取銀杏葉中黃酮類化合物，并利用響應(yīng)面的方法優(yōu)化試驗(yàn)條件，探究最佳試驗(yàn)條件，此提取方法相比較傳統(tǒng)的提取方法，大大縮短了試驗(yàn)時(shí)間的同時(shí)提高了黃酮類化合物的提取量，具有非常重要、深遠(yuǎn)的意義，為銀杏葉黃酮類化合物的更廣泛應(yīng)用提供了強(qiáng)而有力的支持[6-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用儀器見表1。

表1 試驗(yàn)儀器Table 1 Experimental equipment

試驗(yàn)所用試劑見表2。

表2 試驗(yàn)試劑Table 2 Experimental reagent

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，以去離子水定容至50 mL，配制成濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.10、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.6 mL 到10 mL 棕色容量瓶中，加入70%乙醇，使得溶液體積為2 mL，再加入5%NaNO20.3 mL，搖勻靜置6 min，加入10 %Al（NO3）30.3 mL，搖勻靜置6 min，加入10%NaOH 3.0 mL，搖勻靜置15 min。配制蘆丁含量為：0、0.001 8、0.003 6、0.007 1、0.010 7、0.014 3、0.017 9、0.025、0.022 6 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液[11]。紫外吸光度的測(cè)量：開機(jī)預(yù)熱紫外分光光度儀0.5 h，分別在510 nm 處測(cè)量吸光度，記錄吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 黃酮類化合物檢測(cè)方法的方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.2.1 準(zhǔn)確度

取蘆丁含量為：0.035 7 mg/mL 的供試品溶液，加入蘆丁含量為0.071 4 mg/mL 的對(duì)照品溶液混合，每個(gè)濃度制備3 份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，對(duì)9 個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)[12-16]?；厥章视?jì)算見公式（1）：

式中：C 為實(shí)測(cè)值；A 為供試品所含被測(cè)成分量；B為加入對(duì)照品量，利用公式（2）計(jì)算得到的回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：

1.2.2.2 精密度

利用重復(fù)性來表示試驗(yàn)精密度，取蘆丁含量為0.003 6 mg/mL 的供試品溶液，測(cè)定6 次，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.2.3 線性

本試驗(yàn)的線性即為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.4 定量限

將濃度為0.001 8 mg/mL 的溶液測(cè)量吸光度后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算定量限。

1.2.2.5 范圍

將檢測(cè)范圍定為線性范圍的±20%，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算檢測(cè)范圍。

1.2.2.6 耐用性

利用溶液的穩(wěn)定性來衡量試驗(yàn)方法的耐用性，取0.023 mg/mL 的待測(cè)溶液避光靜置0、1、2、3、4、5、7、10、13、24 h 后分別用分光光度計(jì)測(cè)定含量。

1.2.3 銀杏葉總黃酮的提取與檢測(cè)、計(jì)算方法

1.2.3.1 銀杏葉中總黃酮的提取方法

將銀杏葉打磨成粉，過60 目篩，密封后，放入避光處保存。取10 g 已過篩的銀杏葉粉稱量，加入到200 mL 70%的乙醇溶液中，使得液料比為20∶1（mL/g），將溶液放入微波催化合成萃取儀中，設(shè)置微波提取參數(shù)為：微波功率100 W，微波時(shí)間2.0 min。完成微波輔助提取后，將溶液攪拌均勻，倒入250 mL 燒杯中，放入超聲波細(xì)胞粉碎儀中，進(jìn)行超聲波提取，設(shè)置超聲波輔助提取參數(shù)：超聲間隙和超聲時(shí)間2 s/2 s，超聲功率為228 W，超聲時(shí)間4 min。超聲波輔助提取完成后，將溶液放入低速離心機(jī)，設(shè)置離心機(jī)參數(shù)：離心轉(zhuǎn)速1 500 r/min，離心時(shí)間5 min，待離心完成后，取上清液備用，取沉淀物進(jìn)行二次提取，將二次提取離心后上清液與第一次提取上清液混合，即為提取液，記錄提取液體積[17-20]。

1.2.3.2 總黃酮含量檢測(cè)及計(jì)算方法

取提取液1 mL 于10 mL 容量瓶中，以70%乙醇定容到10 mL，取1 mL 稀釋液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線黃酮類化合物的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，將測(cè)得的紫外吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算銀杏葉中總黃酮類化合物的含量，計(jì)算公式如公式3。

式中：A表示紫外分光光度儀檢測(cè)數(shù)據(jù)；B表示稀釋倍數(shù)；V表示提取液總體積，mL；m表示銀杏葉粉的質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 超聲時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取量的影響

按照試驗(yàn)參數(shù)：微波功率100 W，微波時(shí)間2.0 min，液料比20∶1（mL/g），超聲功率228 W，探究超聲時(shí)間分別為0、2、4、6、8 min 時(shí)對(duì)黃酮類化合物提取量的影響。

1.2.4.2 超聲功率對(duì)黃酮類化合物提取量的影響

按照試驗(yàn)參數(shù)：液料比20∶1（mL/g），微波功率100 W，微波時(shí)間2.0 min，超聲時(shí)間4 min，改變超聲功率，探究超聲功率分別為204、216、228、240、252 W 時(shí)對(duì)黃酮類化合物提取量的影響。

1.2.4.3 微波時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取量的影響

按照試驗(yàn)參數(shù)：液料比20∶1（mL/g），微波功率100 W，超聲時(shí)間4 min，超聲功率228 W，探究微波時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min 對(duì)黃酮類化合物提取量的影響。

1.2.4.4 液料比對(duì)黃酮類化合物提取量的影響

按照試驗(yàn)參數(shù)：微波功率100 W，微波時(shí)間2.0 min，超聲時(shí)間4 min，超聲功率228 W，改變液料比，探究液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）時(shí)液料比對(duì)黃酮類化合物提取量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

以超聲功率（A），超聲時(shí)間（B），液料比（C），微波時(shí)間（D）為影響因素，黃酮類化合物為響應(yīng)值，利用design expert 8.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析擬合，對(duì)影響因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平編碼見表3。

表3 試驗(yàn)因素水平編碼Table 3 Experimental factors level and the coding

1.2.6 提取物鑒定

對(duì)提取液進(jìn)行旋蒸濃縮，冷凍干燥后得到提取物粉末。對(duì)粉末進(jìn)行紅外掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

即：y=12.256 7x+0.003 96，R2=0.999 04，符合2015年版中華人民共和國藥典一部要求。

2.2 黃酮類化合物檢測(cè)方法的方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 準(zhǔn)確度

試驗(yàn)所得回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.19%，符合2015年版中華人民共和國藥典一部要求。

2.2.2 精密度

取濃度為0.003 6 mg/mL 的溶液紫外吸光度，吸光度測(cè)定6 次均為：0.044，試驗(yàn)顯示，重復(fù)性良好，符合2015年版中華人民共和國藥典一部要求。

2.2.3 線性

試驗(yàn)線性即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)顯示，y=12.256 7x+0.003 96，R2=0.999 04，線性良好，詳見2.1。

2.2.4 定量限

所以將檢測(cè)限定為0.001 8 mg/mL，R2達(dá)到0.999 04，符合2015年版中華人民共和國藥典一部要求。

2.2.5 范圍

蘆丁檢測(cè)范圍試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 蘆丁檢測(cè)范圍Fig.2 Rutin detection range

由圖2可知，將檢測(cè)范圍定為：0～0.03 mg/mL，R2達(dá)到0.999 41，符合2015年版中華人民共和國藥典一部要求。

2.2.6 耐用性

黃酮類化合物溶液穩(wěn)定性結(jié)果見圖3。

圖3 黃酮類化合物溶液穩(wěn)定性Fig.3 Stability of flavonoid solution

由圖3可知，黃酮類化合物隨著時(shí)間的延長，含量會(huì)逐漸下降，所以黃酮類化合物的含量應(yīng)盡快檢測(cè)，黃酮類化合物溶液也需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 超聲時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取量的影響

超聲時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取量的影響結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction of flavonoids

由圖4可知，超聲時(shí)間在4 min 時(shí)，黃酮類化合物的提取量最高，達(dá)到24.309 5 mg/g，超聲時(shí)間過短，會(huì)造成黃酮類化合物提取不完全，超聲時(shí)間過長，提取量下降迅速，超聲時(shí)間過長過強(qiáng)，會(huì)使得過強(qiáng)空化作用破壞了黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，從而使得黃酮類化合物的提取量降低。

2.3.2 超聲功率對(duì)黃酮類化合物提取量的影響

超聲功率對(duì)黃酮類化合物提取量的影響結(jié)果如圖5。

圖5 超聲功率對(duì)黃酮類化合物提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction of flavonoids

由圖5可知，超聲功率在228 W 時(shí)提取量最高，達(dá)到24.309 5 mg/g，超聲功率過小，使得黃酮類化合物提取不完全，同樣的，超聲功率過強(qiáng)，提取量下降迅速，過強(qiáng)的空化作用會(huì)破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，從而使得黃酮類化合物的提取量降低。

2.3.3 微波時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取量的影響

微波時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取量的影響結(jié)果見圖6。

圖6 微波時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取量的影響Fig.6 Effect of microwave time on the extraction of flavonoids

由圖6可知，微波時(shí)間為2.0 min 時(shí)，黃酮類化合物的提取量最高，達(dá)到24.309 5 mg/g，微波時(shí)間多短，使得黃酮類化合物不能完全從銀杏葉中提取出來，微波時(shí)間過長，提取溫度上升過高過快，會(huì)破壞了黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，從而降低了黃酮類化合物的提取量。

2.3.4 液料比對(duì)黃酮類化合物提取量的影響

液料比對(duì)黃酮類化合物提取量的影響結(jié)果見圖7。

圖7 液料比對(duì)黃酮類化合物提取量的影響Fig.7 Effect of liquid-material ratio on the extraction of flavonoids

由圖7可知，液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，黃酮類化合物提取量最高，達(dá)到24.309 5 mg/g，當(dāng)液料比過小時(shí)，黃酮類化合物提取不完全，液料比過大時(shí)，過高的乙醇濃度會(huì)破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，從而降低了黃酮類化合物的提取量。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

利用design expert 8.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析擬合，得到黃酮類化合物對(duì)A，B，C，D的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=24.31-0.088×A+0.13×B+0.10×C+0.17×D-0.76A×B+0.013×A×D+0.064×B×C+0.35×B×D-0.28×C×D-0.90A2-1.35×B2-1.86×C2-0.33×D2

對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，共29 組響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果見表4。

響應(yīng)面所得到的回歸方程顯著性參數(shù)見表5。

表4 黃酮類化合物響應(yīng)面設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)Table 4 Response surface design data of flaronoids

表5 回歸方程顯著性及方差分析Table 5 Regression coefficients and ANOVA results

續(xù)表5 回歸方程顯著性及方差分析Continue table 5 Regression coefficients and ANOVA results

由表5可以看出此模型的P值為0.008 2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.01，回歸方程相關(guān)系數(shù)為0.936 5，證明此模型的顯著性為顯著，擬合模型較好，該試驗(yàn)的設(shè)計(jì)合理，所得到的回歸方程可以較好地反映各個(gè)因素對(duì)于黃酮類化合物提取量的影響，利用該模型得到的最佳工藝條件是合理的。各個(gè)因素對(duì)黃酮類化合物的影響排序?yàn)椋何⒉〞r(shí)間＞超聲時(shí)間＞液料比＞超聲功率，交互項(xiàng)對(duì)黃酮類化合物影響排序?yàn)槌暪β逝c超聲時(shí)間＞超聲時(shí)間與微波時(shí)間＞液料比與微波時(shí)間＞超聲功率與微波時(shí)間大于超聲時(shí)間與液料比，二次項(xiàng)對(duì)黃酮類化合物影響排序?yàn)椋阂毫媳龋境晻r(shí)間＞超聲功率＞微波時(shí)間。

試驗(yàn)中各個(gè)因素交互作用響應(yīng)立體面及對(duì)應(yīng)等高線圖8。

由響應(yīng)面所得到的等高線圖和3D 圖見圖8，等高線所得的趨勢(shì)線越似橢圓，兩個(gè)因素的交互作用就越明顯，所以由圖8可知，超聲功率與超聲時(shí)間的交互作用最明顯，而超聲時(shí)間與液料比之間的交互作用最弱。同時(shí)，由各個(gè)因素所得到的3D 圖可知，響應(yīng)面最高點(diǎn)對(duì)應(yīng)的各個(gè)因素值即為最佳試驗(yàn)條件，最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的縱坐標(biāo)即為黃酮類化合物的最高提取量[21-23]。

圖8 黃酮類化合物響應(yīng)立體圖與等高線圖Fig.8 Contour map and 3D plot of flavonoid response surface

根據(jù)響應(yīng)面分析得到的黃酮類化合物最佳試驗(yàn)條件為：超聲功率：227.4 W，超聲時(shí)間：2.16 min，液料比：19.75∶1（mL/g），微波時(shí)間：1.985 min。為方便試驗(yàn)操作，最佳條件設(shè)定為：超聲功率：228 W，超聲時(shí)間：2 min，液料比20∶1（mL/g），微波時(shí)間2 min。為檢驗(yàn)上述所得最佳試驗(yàn)條件的可靠性，利用上述最佳工藝條件提取黃酮類化合物，得到黃酮類化合物的提取量為24.309 5 mg/g，理論上可得到黃酮類化合物的提取量為24.322 5 mg/g，相對(duì)誤差為0.05%。

2.5 提取物的鑒定

提取物紅外掃描圖譜見圖9。

圖9 提取物的紅外光譜圖Fig.9 Infrared spectrum of the extract

根據(jù)圖9，芳香環(huán)的C-H 伸縮振動(dòng)峰為3 364、1 657 cm-1為羰基吸收峰，羰基峰本身是出現(xiàn)在1 740 cm-1～1 700 cm-1的峰，此譜圖羰基峰出現(xiàn)紅移是由于羰基與芳香基出現(xiàn)共軛而引起的。1 607 cm-1為苯環(huán)骨架的伸縮振動(dòng)峰，1 273 cm-1為芳香醚的特征吸收峰。

黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)見圖10。

由圖10 可知，提取物紅外掃描結(jié)果與與圖10中黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)一致，所以提取產(chǎn)物確定為黃酮類化合物。

圖10 黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)Fig.10 Basic structure of flavonoids

3 結(jié)論與展望

該文采用的微波-超聲聯(lián)合提取黃酮類化合物的方法不僅可以明顯縮短試驗(yàn)時(shí)間，并且在很大程度上提高了銀杏葉中黃酮類化合物的提取量，同時(shí)，本文采用Design-Expert 軟件來設(shè)計(jì)各個(gè)影響因素的響應(yīng)面試驗(yàn)，建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化了試驗(yàn)條件，當(dāng)在響應(yīng)面優(yōu)化的最佳試驗(yàn)條件：超聲時(shí)間4 min，超聲功率228 W，微波時(shí)間2 min，液料比20∶1（mL/g），銀杏葉中總黃酮的最高提取量達(dá)到24.309 5 mg/g。表明此項(xiàng)研究有著重要的意義，為銀杏葉中黃酮類化合物的應(yīng)用提供了更廣闊的前景。