菌酶協(xié)同發(fā)酵水解大米蛋白ACE抑制肽及其活性的研究

鄒俊哲，林凱，譙飛，楊旭，劉紅彥，楊艷艷，劉漢民，韓雪，*，張?zhí)m威，5，*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)中心，山東青島266003；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090；3.哈爾濱市食品工業(yè)研究所有限公司，黑龍江哈爾濱150090；4.中恩（天津）營(yíng)養(yǎng)科技有限公司，天津300000；5.華羚生物技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730000）

目前，中國(guó)腎病患者已超過(guò)一億人，腎臟作為人體內(nèi)蛋白重吸收的主要器官，一旦受到損傷或病變后，日常蛋白的攝入尤其是植物蛋白就會(huì)對(duì)腎病患者造成代謝負(fù)擔(dān)。低蛋白飲食可以減輕腎臟負(fù)擔(dān)并且減緩腎臟病變的幾率[1]。長(zhǎng)久以來(lái)，大米已成為中國(guó)人餐桌上的主食，但腎病患者因受到疾病的困擾，不能過(guò)多的攝入大米蛋白[2]，進(jìn)而嚴(yán)重影響了腎病患者的生活品質(zhì)、心理健康和社會(huì)關(guān)系等[3]。大米中含有約為7.5%的大米蛋白，在制備低蛋白大米時(shí)，大米蛋白會(huì)以蛋白水解物形式轉(zhuǎn)入到脫除液中，脫除液的排放會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。然而，脫除液中的蛋白及多肽是一種可利用資源，因此有效的利用大米蛋白脫除液，能夠?qū)崿F(xiàn)其廢物利用并增加其附加值。

多種蛋白序列中均包含有血管緊張素I 結(jié)構(gòu)類(lèi)似的多肽序列。目前，利用各種蛋白酶對(duì)油菜籽蛋白[4]、大豆蛋白[5]和蘑菇[6]等不同蛋白進(jìn)行水解，分離純化出了多種具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制活性的多肽，并且具有良好的降壓活性。有研究利用乳酸桿菌繼續(xù)處理經(jīng)蛋白酶脫蛋白后的大米，但研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌并沒(méi)有進(jìn)一步脫除大米蛋白[7]。因此，利用菌酶組合脫除大米蛋白時(shí)，應(yīng)考慮使用何種蛋白酶和菌進(jìn)行組合及菌酶脫蛋白的先后順序等影響因素。近年來(lái)，利用食源性蛋白制備ACE 抑制肽在治療高血壓方面已成為研究熱點(diǎn)[8]。本文主要目的是考察植物乳桿菌2-18 及枯草芽孢桿菌Y、枯草芽孢桿菌Y4-2 和蛋白酶聯(lián)合使用對(duì)大米中大米蛋白脫除率的影響，同時(shí)考察了大米蛋白脫除液的ACE 抑制活性，為大米蛋白的利用提供試驗(yàn)方法并且奠定理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

試驗(yàn)用大米由天津市寶坻區(qū)喜旺米加工有限公司提供；枯草芽孢桿菌Y（Bacillus subtilisY）、枯草芽孢桿菌Y4-2（Bacillus subtilisY4-2）由天然發(fā)酵的納豆中分離獲得，植物乳桿菌2-18（Lactobacillus plantarum2-18）由江米發(fā)酵酒中分離獲得，貯藏于哈爾濱工業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

胃蛋白酶（800 U/mg）、ACE（1 UN）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸水合物（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、Leu-Leu（色譜純）：美國(guó)Sigma 公司，風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶（500 U/mg）、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶（200 U/mg）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；乙酸乙酯（分析純）：天津科密歐試劑有限公司；細(xì)胞色素C、抑肽酶、血管緊張素II、氧化型谷胱甘肽（色譜純）：阿拉丁試劑有限公司。

3-30K 高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma 公司；5BG 生物發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；Millipore8400 超濾杯：美國(guó)密理博公司；L-8800 氨基酸自動(dòng)分析儀：日本日立公司；UV-5100 分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.2 菌體在大米發(fā)酵體系中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

發(fā)酵前Bacillus subtilisY、Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 分別在MRS 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，然后以3%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于大米發(fā)酵體系中培養(yǎng)10 h。Lactobacillus plantarum2-18培養(yǎng)溫度為40 ℃，Bacillus subtilisY、Bacillus subtilisY4-2 培養(yǎng)溫度為37 ℃。分別培養(yǎng)到2、4、6、8、10 h 時(shí)，分別吸取1 mL 發(fā)酵液，經(jīng)稀釋后涂布于MRS 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，繪制菌體在大米發(fā)酵體系中的生長(zhǎng)曲線。

1.3 菌體產(chǎn)蛋白酶酶活的測(cè)定

菌體培養(yǎng)過(guò)程中分別在特定時(shí)間（2、4、6、8、10 h）收集培養(yǎng)液進(jìn)行菌體產(chǎn)蛋白酶酶活的測(cè)定。首先，將培養(yǎng)液于4 000 r/min 離心5 min 去除菌體等雜質(zhì)，取上清液。然后，將培養(yǎng)液稀釋一定倍數(shù)后，按照He 等測(cè)定酶活方法測(cè)定3 株菌產(chǎn)蛋白酶的酶活力[9]。

1.4 菌發(fā)酵大米蛋白水解率的測(cè)定

將大米洗滌后加入等量的去離子水（1∶1，kg/kg），預(yù)熱到相應(yīng)的發(fā)酵溫度，Bacillus subtilisY，Bacillus subtilisY4-2 發(fā)酵溫度為37 ℃，Lactobacillus plantarum2-18 發(fā)酵溫度為40 ℃。Bacillus subtilisY、Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 的接種量為5%（mL/L）。在115 r/min 振蕩條件下發(fā)酵9 h，過(guò)濾獲得濾液。用去離子水清洗發(fā)酵后的大米，清洗后的大米于120 ℃下烘干6 h，得到脫蛋白大米。參考Guo等的方法使用凱氏定氮測(cè)定大米的蛋白脫除率[10]，同時(shí)提取大米蛋白發(fā)酵液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳分析[11]。

1.5 菌酶組合發(fā)酵水解大米蛋白

選取堿性蛋白酶（alcelase，A）、酸性蛋白酶（acid protease,Ac）、風(fēng)味蛋白酶（flavourzyme，F(xiàn)）、菠蘿蛋白酶（bromelain，B）、胰蛋白酶 （trypsin，T）和胃蛋白酶（pepsin，P）結(jié)合Bacillus subtilisY、Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 進(jìn)行菌酶組合發(fā)酵水解大米蛋白，酶反應(yīng)最適條件如表1所示。

表1 蛋白酶最適酶解條件Table 1 Optimized parameters for the hydrolysis of enzymes

菌酶組合分別為Y+B/F+A、Y+B/F+Ac/P、Y4-2+B/F+A、Y4-2+B/F+Ac/P、2-18+Ac/P+B/F 分步脫除大米蛋白。以2-18+Ac/P+B/F 組合分步脫除大米蛋白為例：將Lactobacillus plantarum2-18 以5%（L/L）接種于大米發(fā)酵液中，于40 ℃115 r/min 條件下發(fā)酵9 h，過(guò)濾收集濾液，用去離子水清洗經(jīng)Lactobacillus plantarum2-18 發(fā)酵的大米；調(diào)整pH 值至2.5，加入0.3%（E/S）胃蛋白酶/酸性蛋白酶，控制溫度為40 ℃30 r/min 條件下發(fā)酵18 h，過(guò)濾收集濾液，用等量蒸餾水清洗大米；調(diào)整大米發(fā)酵液pH 值至6.8，溫度為45 ℃，加入0.3%（E/S）風(fēng)味蛋白酶/菠蘿蛋白酶，于45 ℃30 r/min條件下發(fā)酵18 h，過(guò)濾收集過(guò)濾液，用蒸餾水清洗大米。同時(shí)測(cè)定大米蛋白脫除率。將Lactobacillus plantarum2-18 發(fā)酵液與2 次蛋白酶酶解液收集合并，經(jīng)8 000 r/min 離心10 min，去除菌體和顆粒等雜質(zhì)。最后經(jīng)冷凍干燥后，將樣品置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 大米蛋白水解液氨基酸分析

取大米蛋白水解樣品（100 mg）于樣品管中，向樣品管中加入2 mL 濃HCl（6.0 mol/L），樣品管于真空條件下110 ℃水解22 h。待溫度降至室溫后，向樣品管中加入10 mL NaOH（6.0 mol/L），最后使用去離子水定容至25 mL。樣品溶液與HCl（0.02 mol/L）以1∶1（mL/mL）混合，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后，使用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸組成分析。氨基酸檢測(cè)條件：標(biāo)準(zhǔn)分析柱4.6 mm×60.0 mm，反應(yīng)柱溫度為57.0 ℃，反應(yīng)器溫度為136 ℃。必需氨基酸（essential amino acid，EAA）評(píng)價(jià)：采用氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）系數(shù)法對(duì)大米蛋白水解肽進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)，計(jì)算公式如下所示：

1.7 大米蛋白水解液中多肽分子量分布的測(cè)定

樣品處理：將大米蛋白發(fā)酵水解液經(jīng)冷凍干燥后，用流動(dòng)相配制成1 g/L 的溶液，然后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，采用體積排阻色譜分析大米蛋白發(fā)酵水解液多肽分子量的分布。分子量分布曲線利用含有Leu-Leu（分子量：226 Da）、氧化型谷胱甘肽（分子量：615 Da）、血管緊張素Ⅱ（分子量：1 046 Da）、抑肽酶（分子量：6 500 Da）和細(xì)胞色素C（分子量：12 500 Da）的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行繪制。

體積排阻色譜條件：色譜柱為T(mén)SK gel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）凝膠柱；流動(dòng)相：乙腈∶水∶三氟乙酸（mL/mL/mL）=10∶90∶0.1；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；泵流速設(shè)為0.5 mL/min；柱溫箱溫度為30 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL[12]。

1.8 大米蛋白發(fā)酵水解液ACE抑制活性的測(cè)定

參考Lin 等[13]的方法測(cè)定ACE 抑制率測(cè)：取25 μL樣品加入125 μL 的馬尿酰組氨酸亮氨酸（N-hippuril-L-histidy-L-leucine，HHL），于37 ℃水浴預(yù)熱5 min，加入20 μL 的ACE（0.1 U/mL）。將上述混合溶液置于37 ℃水浴孵育1 h，然后加入350 μL HCl（1 mol/L）用于終止反應(yīng)。向試管中加入1.7 mL 乙酸乙酯用于萃取生成的馬尿酸，將上述溶液充分旋渦振蕩15 s 后，4 000 r/min 離心5 min，靜置放置分層后，取上層清液1 mL 置于120 ℃干燥箱內(nèi)烘干，冷卻后加入1 mL 去離子水溶解，超聲5 min 后于228 nm 處測(cè)定吸光值。ACE 抑制活性通過(guò)下式計(jì)算：

式中：A為空白組（即將25 μL 樣品換成緩沖液）吸光值；B為樣品組吸光值；C為ACE 失活組（即在加入ACE 之前先加入350 μL HCl，使ACE 失活）吸光值。

1.9 數(shù)據(jù)分析

本研究每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次。利用SPSS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（oneway ANOVA）中Duncan＇s 法進(jìn)行分析，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 Bacillus subtilis Y、Bacillus subtilis Y4-2和Lactobacillus plantarum 2-18在大米發(fā)酵液中生長(zhǎng)曲線分析

通?？疾炀w在基質(zhì)中的生長(zhǎng)曲線用于分析菌體生長(zhǎng)情況。本試驗(yàn)菌體發(fā)酵大米蛋白液較為渾濁，因此采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)Bacillus subtilis Y、Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 在大米發(fā)酵液中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析。將不同時(shí)間的發(fā)酵液經(jīng)平板計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 B.subtilis Y、B.subtilis Y4-2和L.plantarum 2-18在大米發(fā)酵液中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of B.subtilis Y，B.subtilis Y4-2 和L.plantarum 2-18 in rice

由圖1結(jié)果可知，3 株菌在大米發(fā)酵過(guò)程中均能夠較好的生長(zhǎng)。Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 經(jīng)過(guò)8 h 的生長(zhǎng)，活菌數(shù)均能夠達(dá)到108CFU/mL 數(shù)量級(jí)，生長(zhǎng)優(yōu)于Bacillus subtilisY。

2.2 Bacillus subtilis Y、Bacillus subtilis Y4-2和Lactobacillusplantarum 2-18在大米發(fā)酵液中蛋白酶活的分析

圖2為Bacillus subtilisY，Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 在不同發(fā)酵時(shí)間，大米發(fā)酵液中蛋白酶酶活的檢測(cè)結(jié)果。

圖2 B.subtilis Y、B.subtilis Y4-2和L.plantarum 2-18在大米發(fā)酵液中蛋白酶酶活Fig.2 The enzyme activity of Bacillus subtilis Y，B.subtilis Y4-2 and L.plantarum 2-18 in the rice fermentation liquid

由結(jié)果可知，Lactobacillus plantarum2-18 產(chǎn)生的蛋白酶酶活高于Bacillus subtilisY 和Bacillus subtilisY4-2 產(chǎn)生的蛋白酶酶活，同時(shí)芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶酶活具有顯著差異。Bacillus subtilisY、Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 在發(fā)酵6 h 后酶活的增加均趨于平緩，Bacillus subtilisY 和Bacillus subtilisY4-2 的酶活分別為（30.6±2.0）U/mL 和（59.7±4.7）U/mL，Lactobacillus plantarum2-18 的 酶 活 為（79.9±6.5）U/mL。因此，考慮到3 株菌產(chǎn)生的蛋白酶酶活力，選擇產(chǎn)蛋白酶酶活相對(duì)穩(wěn)定的時(shí)間（9 h）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 Bacillus subtilis Y、Bacillus subtilis Y4-2和Lactobacillus plantarum 2-18對(duì)大米蛋白脫除率的分析

為了考察3 株菌對(duì)大米蛋白的脫除能力，本試驗(yàn)研究了經(jīng)Bacillus subtilisY，Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 發(fā)酵后大米蛋白電泳圖及其蛋白脫除率，圖3為脫蛋白大米蛋白電泳圖，圖4為3 株菌對(duì)大米蛋白脫除率的影響。

圖3 大米經(jīng)B.subtilis Y、B.subtilis Y4-2和L.plantarum 2-18發(fā)酵液電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of fermentation liquid produced by B.subtilis Y，B.subtilis Y4-2 and L.plantarum 2-18

圖4 大米經(jīng)B.subtilis Y、B.subtilis Y4-2和L.plantarum 2-18發(fā)酵后蛋白脫除率Fig.4 Protein removal rate of fermentation liquid produced by B.subtilis Y，B.subtilis Y4-2 and L.plantarum 2-18

通過(guò)SDS-PAGE 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大米蛋白發(fā)酵液電泳條帶主要分布在10、20、35、50 kDa 附近區(qū)域。通過(guò)對(duì)比經(jīng)3 株菌發(fā)酵后的大米蛋白水解產(chǎn)物電泳圖可以發(fā)現(xiàn)，其中Lactobacillus plantarum2-18 發(fā)酵后的大米蛋白顯著減少。通過(guò)考察3 株菌對(duì)大米蛋白脫除率的影響（圖4）發(fā)現(xiàn)，Bacillus subtilisY 和Bacillus subtilisY4-2 水解大米蛋白的能力較弱，分別為（22.35±1.30）%和（19.56±1.60）%，Lactobacillus plantarum2-18 的蛋白脫除率可達(dá)到（37.68±1.70）%，該結(jié)果與電泳試驗(yàn)結(jié)果一致。與Bacillus subtilisY 和Bacillus subtilisY4-2相比，Lactobacillus plantarum2-18 具有更強(qiáng)的水解大米蛋白能力。

2.4 菌酶組合發(fā)酵水解對(duì)大米蛋白效果的分析

試驗(yàn)選取了如圖5所述的菌酶組合，考察了不同菌酶組合對(duì)大米蛋白脫除率的影響。

圖5 不同菌酶組合對(duì)大米脫除率的影響Fig.5 Determination of protein removal rate by different combinations of bacterium with enzymes

通過(guò)測(cè)定不同菌酶組合對(duì)大米蛋白的脫除率可以發(fā)現(xiàn)，相比于菌體單獨(dú)作用大米進(jìn)行脫蛋白而言，菌酶組合能夠更有效的增加大米蛋白的脫除率。當(dāng)菌體單獨(dú)進(jìn)行大米脫蛋白試驗(yàn)時(shí)，Lactobacillus plantarum2-18 的大米蛋白脫除率僅為（37.68±1.70）%，而當(dāng)Lactobacillus plantarum2-18 與胃蛋白酶/酸性蛋白酶和菠蘿蛋白酶/風(fēng)味蛋白酶共同處理大米進(jìn)行脫蛋白時(shí)，大米蛋白脫除率可達(dá)（91.32±1.60）%。因此，將進(jìn)一步考察Lactobacillus plantarum2-18+風(fēng)味蛋白酶/菠蘿蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶組合得到的大米蛋白發(fā)酵水解液的相關(guān)性質(zhì)。

2.5 菌酶組合發(fā)酵水解大米蛋白液氨基酸分析及其營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)

對(duì)Lactobacillus plantarum2-18+胃蛋白酶/酸性蛋白酶+菠蘿蛋白酶/風(fēng)味蛋白酶組合進(jìn)行大米脫蛋白獲得的大米蛋白發(fā)酵水解液進(jìn)行了氨基酸組成成分分析，見(jiàn)表2。

表2 大米蛋白發(fā)酵水解液氨基酸組成及RAA、RC和ARC值Table 2 The amino acids composition of removal liquid of rice and its RAA，RC，SRC values

通過(guò)對(duì)Lactobacillus plantarum2-18+胃蛋白酶/酸性蛋白酶+菠蘿蛋白酶/風(fēng)味蛋白酶組合獲得的大米蛋白發(fā)酵水解液進(jìn)行氨基酸分析，共檢測(cè)到17 種氨基酸，其中必需氨基酸（除色氨酸）占39.62%，非必需氨基酸占60.38%。該組合大米蛋白發(fā)酵水解液SRC 值為91.05，遠(yuǎn)高于豬肉組織（74）和牛肉組織（76）中蛋白的SRC 值。同時(shí)，氨基酸組成分析結(jié)果可知，含硫氨基酸及芳香族氨基酸和亮氨酸RC 值均高于1，為過(guò)剩氨基酸；而賴(lài)氨酸為蛋白脫除液中的限制氨基酸，其RC 值為0.6。亞洲人主要攝入的植物蛋白為大米蛋白，相比于其他植物蛋白，大米蛋白富含多種必需氨基酸，如精氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸等[14-15]。研究表明，大米蛋白具有較低的致敏性，易于腸道消化，可作為嬰兒食用蛋白[16-17]。

2.6 菌酶大米-蛋白發(fā)酵水解液肽的分子量分布

利用體積排阻色譜測(cè)定了不同標(biāo)準(zhǔn)品（Leu-Leu、氧化型谷胱甘肽、血管緊張素Ⅱ、抑肽酶和細(xì)胞色素C）的相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)圖6，標(biāo)準(zhǔn)物的分子質(zhì)量與其保留時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)圖7和樣品的體積排阻色譜分布見(jiàn)圖8。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品體積排阻色譜洗脫曲線Fig.6 The size exclusion chromatography of mixed standard subject

圖7 標(biāo)準(zhǔn)物的分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與其保留時(shí)間的關(guān)系Fig.7 Relationship of lg（MW）of standard subject and retention time

由圖6可知，不同標(biāo)準(zhǔn)物具有良好的分離度；由圖7可知，分子量的對(duì)數(shù)（lgMW）對(duì)保留時(shí)間曲線方程其相關(guān)系數(shù)R2為0.977，表明該校正曲線具有良好的線性相關(guān)；根據(jù)圖8獲得體積排阻色譜圖峰保留時(shí)間，確定樣品蛋白分子量分布見(jiàn)表3。

表3 大米蛋白肽的分子量分布Table 3 The distribution of molecular weight of peptides

由表3可知，大米蛋白菌酶發(fā)酵水解液中蛋白分子量分布范圍為：＜1 000 Da（22.82%）、1 000 Da～1 500 Da（41.66 %）、1 500 Da～3 000 Da（24.34 %）、＞3 000 Da（11.18%）。試驗(yàn)結(jié)果表明，在利用菌酶組合發(fā)酵水解大米蛋白的同時(shí)，大分子蛋白被水解生成多肽。

圖8 樣品體積排阻色譜譜圖Fig.8 The size exclusion chromatography of sample

2.7 米蛋白菌酶發(fā)酵水解液ACE抑制活性分析

Lactobacillus plantarum2-18、胃蛋白酶/酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶/風(fēng)味蛋白酶及其組合發(fā)酵水解大米蛋白液肽分析可知，多肽分子量主要分布在1 000 Da ～3 000 Da 之間，前人研究表明具有ACE 抑制活性的肽分子量通常小于3000 Da[18]，本研究測(cè)定了Lactobacillus plantarum2-18、胃蛋白酶/酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶/風(fēng)味蛋白酶及其組合發(fā)酵大米產(chǎn)生的脫蛋白液（＜3 000 Da）的ACE 抑制活性，結(jié)果見(jiàn)圖9。

由圖9可知，菌、酶單獨(dú)作用時(shí)，大米蛋白發(fā)酵水解液均具有一定的ACE 抑制活性，其ACE 抑制率分別為 （20.15±3.56）%（Lactobacillus plantarum2-18）、（30.21±2.120）%（酸性蛋白酶/胃蛋白酶）和（24.43±3.21）%（菠蘿蛋白酶/風(fēng)味蛋白酶）。而當(dāng)菌酶組合，大米蛋白發(fā)酵水解液的ACE 抑制活性顯著升高，經(jīng)過(guò)Lactobacillus plantarum2-18+風(fēng)味蛋白酶/菠蘿蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶分步脫蛋白得到的大米蛋白發(fā)酵水解液ACE 抑制率達(dá)到（91.95±1.63）%。利用菌酶組合發(fā)酵水解大米蛋白，不僅能夠提升蛋白水解液的生物學(xué)功能，同時(shí)還能夠降低大米中的蛋白含量使其滿足腎病患者的飲食需求[19-20]。

圖9 不同菌酶組合的發(fā)酵水解液的ACE抑制率Fig.9 ACE inhibitory activities of the hydrolysates produced by different combinations of bacterium with enzymes

3 結(jié)論

研究利用菌酶單獨(dú)或組合方式對(duì)大米脫蛋白效果及大米蛋白發(fā)酵水解液相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了研究。Lactobacillus plantarum2-18+風(fēng)味蛋白酶/菠蘿蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶組合具有良好的大米蛋白脫除效果，蛋白脫除率可達(dá)（91.32±1.60）%。通過(guò)對(duì)該菌酶組合獲得的大米蛋白發(fā)酵水解液進(jìn)行分子量分布分析，確定蛋白肽分子量主要集中于1 000 Da～3 000 Da 之間。對(duì)該蛋白發(fā)酵水解液進(jìn)行超濾分級(jí)，確定其中小于3 000 Da 蛋白肽的ACE 抑制活性最高，抑制率達(dá)（91.95±1.63）%，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。