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    常見SPF級(jí)小鼠和大鼠腸道菌群多樣性研究

    2019-04-28 03:39:42黃樹武閔凡貴王靜潘金春
    關(guān)鍵詞:菌門品系菌群

    黃樹武,閔凡貴,王靜,潘金春

    (廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所,廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東廣州 510663)

    據(jù)統(tǒng)計(jì),人體攜帶的正常微生物達(dá)1014個(gè),胃腸道菌群占人體總微生物量的78%[1]。胃腸道作為人和動(dòng)物體最龐大而復(fù)雜的生物群落,正常情況下腸道菌群保持著共生和拮抗的關(guān)系,從消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、能量供應(yīng)、脂肪代謝、免疫調(diào)節(jié)、藥物代謝和毒性等諸多方面影響人和動(dòng)物的健康狀況[2]。

    在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中,以小鼠、大鼠為主的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物占據(jù)主要地位,2015年其使用量合計(jì)約占實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用總量的74%[3]。目前已經(jīng)有相關(guān)研究開展小鼠和大鼠的腸道菌群與心血管疾病、代謝性疾病、病原感染等疾病的關(guān)系[4-5],腸道菌群代謝產(chǎn)物研究,腸道菌群多樣性影響因素研究[6]等,但實(shí)驗(yàn)大小鼠常用品系腸道微生態(tài)情況研究尚不夠充分,且研究方法多采用培養(yǎng)法、擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析、PCR-DGGE電泳等傳統(tǒng)方法,導(dǎo)致結(jié)果差異較大。

    本研究采用新一代Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析手段,對(duì)常用的實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠開展腸道菌群多樣性分析,可以全面、平行分析多個(gè)樣本中的微生物群落信息,從而掌握常用小鼠和大鼠腸道菌群多樣性背景,其數(shù)據(jù)易于分享和比對(duì),解決目前研究中存在的不足,為微生態(tài)與相關(guān)疾病、代謝產(chǎn)物、藥物篩選和評(píng)價(jià)等相關(guān)研究提供基礎(chǔ)性資料,以及在選擇腸道微生態(tài)研究用模型動(dòng)物時(shí)提供參考依據(jù),對(duì)促進(jìn)生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)小鼠和大鼠來(lái)自廣東地區(qū)三家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位,三個(gè)生產(chǎn)單位分別用代號(hào)DJ【生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2018-0044】、ZY【生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2018-0034】、SY【生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2018-0002】表示,動(dòng)物包括小鼠品系C57BL/6、ICR、BALB/c和大鼠品系Wistar、SD,具體信息見表1。

    表1 SPF級(jí)小鼠和大鼠的信息Table 1 Information of the SPF grade laboratory animals

    1.1.2 儀器與試劑

    儀器為FTC-3000TM實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀。試劑為QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司;AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司;PCR反應(yīng)所用試劑 10× PCR緩沖液、4x dNTP、Taq酶、DL-2000 marker、蛋白酶K,瓊脂糖(電泳級(jí)),pMDl9-T載體、T4 DNA連接酶、Tax/Plus聚合酶等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品采集

    采用 CO2吸入法對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉,再用頸椎脫臼的方法實(shí)施安樂死,動(dòng)物安樂死后解剖取盲腸內(nèi)容物約1 g,實(shí)驗(yàn)操作在廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所實(shí)驗(yàn)設(shè)施【使用許可證編號(hào):SYXK(粵)2016-0122】,所有操作符合動(dòng)物福利和倫理要求。

    1.2.2 DNA文庫(kù)制備與高通量測(cè)序

    使用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒抽提樣品基因組DNA。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA V4-V5區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物序列,構(gòu)建目標(biāo)區(qū)域和帶有“5’Miseq接頭-barcode-測(cè)序引物-特異引物-3’”的融合引物。采用兩步PCR擴(kuò)增的方法構(gòu)建NDA文庫(kù)(引物序列見表2),首先采用內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增目的片段,后將目的片段使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收,而后將回收產(chǎn)物作為模板采用外側(cè)引物進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增,并使用FTC-3000TMreal-time PCR儀進(jìn)行定量,均一化混勻后文庫(kù)制備結(jié)束,采用Illumina Miseq 2× 300 bp 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

    表2 引物序列Table 2 Primer sequences

    1.2.3 生物信息學(xué)分析

    Miseq測(cè)序原始序列用Trimmomatic和FLASH軟件進(jìn)行質(zhì)控、過濾、拼接,再用 Mothur軟件處理去除錯(cuò)誤序列、重復(fù)序列以獲得優(yōu)化序列,優(yōu)化序列用USEARCH和Mothur軟件進(jìn)行運(yùn)算分類單位(operational taxonomic units,OTU)聚類分析(在97%的相似性水平下劃分)和物種分類學(xué)分析,基于OTU聚類分析結(jié)果,再用Mothur軟件和R語(yǔ)言進(jìn)行Alpha對(duì)樣品微生物群落的豐度和多樣性進(jìn)行分析;基于分類學(xué)信息,可以在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析,并對(duì)樣本之間進(jìn)行Beta多樣性分析,并繪制圖表。

    2 結(jié)果

    2.1 序列優(yōu)化及統(tǒng)計(jì)

    22個(gè)樣品進(jìn)行處理共獲得696 394個(gè)優(yōu)化序列,平均每個(gè)樣品31 000多個(gè)序列。這些序列在97%的相似水平下聚類獲得OTU,平均每個(gè)樣品獲得151個(gè)OTU,但樣品間數(shù)量差異較大,其中來(lái)源DJ的OTU平均為253個(gè),來(lái)源SY的OTU平均為310個(gè),來(lái)源ZY的OTU數(shù)量較少,平均為53個(gè)。

    2.2 OTU聚類分析

    為驗(yàn)證樣品的測(cè)序深度,從樣品中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體,以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建稀釋性曲線(rarefaction curves),結(jié)果顯示所有樣品的曲線都趨于平緩(圖1),說明本次測(cè)序的數(shù)據(jù)量合理,能夠覆蓋樣本的絕大部分微生物。

    圖1 稀釋性曲線Figure 1 Rarefaction curves

    分別用Jaccard 法和Bray-Cutis 法計(jì)算樣品之間的差異性,并采用UPGAM法繪制樹形圖(圖2)。結(jié)果顯示,同一設(shè)施來(lái)源的動(dòng)物菌群組成相似性較高;且來(lái)源于相同設(shè)施的同一品系動(dòng)物之間存在一定相似性,如DJ-1 ~ DJ-3、DJ-11 ~ DJ-14、SY-1 ~ SY-3等。

    注:A.矩陣熱圖(Jaccard法);B.矩陣熱圖(Bray-Cutis法);C.樹狀圖(Jaccard法);D. 樹狀圖(Bray-Cutis法)圖2 多樣本相似性分析Note. A. Matrix heat map (Jaccard). B. Matrix heat map (Bray-Cutis). C. Tree pattern (Jaccard). D. Tree pattern (Bray-Cutis).Figure 2 Multi-sample similarity analysis

    2.3 物種信息分析

    從門水平聚類分析,小鼠、大鼠腸道菌群主要分成擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、無(wú)壁菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)八個(gè)門(圖3A),其中擬桿菌門、厚壁菌門占據(jù)主要地位,二者合計(jì)所占比例達(dá)到85%以上。從來(lái)源來(lái)看,菌群組成略有差異,來(lái)源DJ的動(dòng)物缺少放線菌門和梭桿菌門,來(lái)源ZY的動(dòng)物缺少放線菌門,來(lái)源SY的動(dòng)物缺少梭桿菌門。品種品系也存在差異,小鼠沒有放線菌門,大鼠沒有梭桿菌門,ICR小鼠還沒有梭桿菌門,Wistar大鼠還沒有放線菌門。從聚類結(jié)果看,來(lái)源SY和ZY的相似性較高。

    從屬水平聚類分析,除未分類的細(xì)菌外,小鼠、大鼠腸道菌群共分成63個(gè)屬,其中比例最高的是擬桿菌屬(Bacteroides),平均約占40%。其次較多的屬包括Hungatella、副桿狀菌屬(Parabacteroides)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、Mucispirillum、Ruminiclostridium、Akkermansia、羅氏菌屬(Roseburia)等(圖3B)。從品種、品系比較看,主要優(yōu)勢(shì)菌屬組成都較接近,部分品種、品系可能缺乏一些低豐度的菌屬,如大鼠未檢到巨單胞菌屬(Megamonas)、Papillibacter、Catenibacterium、梭菌屬(Fusobacterium)等4種菌屬,小鼠未檢到Romboutsia、Butyricimonas、Adlercreutzia、變形桿菌屬(Proteus)、Faecalibaculum、Allobaculum、Arenimonas、Gordonibacter等8種菌屬。從聚類結(jié)果看,來(lái)源DJ和SY的相似性較高。

    圖3 門(A)與屬(B)水平聚類樹與柱狀圖組合分析結(jié)果Figure 3 Results of cluster tree and histogram combination analysis on phylum(A) and genus(B) levels

    圖4 Alpha多樣性分析Figure 4 Alpha diversity analysis

    2.4 Alpha多樣性分析

    通過單樣品的多樣性分析(Alpha 多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性,估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。本次樣品文庫(kù)的平均覆蓋率(coverage指數(shù))為99.91%,反應(yīng)本次測(cè)序深度能代表樣品的真實(shí)情況。根據(jù)香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、Chao指數(shù)和Ace指數(shù)結(jié)果(圖4),總體來(lái)看來(lái)源于DJ、SY的動(dòng)物物種豐富度差不多,都高于來(lái)自ZY動(dòng)物的物種。

    2.5 Beta多樣性分析

    PCoA(principal co-ordinates analysis)是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法,通過PCoA分析可以觀察個(gè)體或群體間的差異。本研究的PCoA分析顯示來(lái)源于DJ、SY、ZY的動(dòng)物分成了三個(gè)群落,且在考慮序列豐度的情況下更為明顯(圖5)。通過Unifrac分析制作差異性矩陣熱圖(圖6),在不考慮序列豐度的情況下(weighted unifrac),結(jié)果顯示與上述差異性分析結(jié)果略有差異,來(lái)源SY與ZY的動(dòng)物菌群差異更小一點(diǎn);而在考慮序列豐度的情況下(unweighted unifrac),結(jié)果顯示與上述差異性分析結(jié)果一致,相同來(lái)源動(dòng)物的腸道菌群差異較小,同時(shí)來(lái)源于DJ、SY動(dòng)物之間腸道菌群的相似性較高,且DJ、SY動(dòng)物品系也對(duì)腸道菌群的相似性有所影響。

    圖5 PCoA分析Figure 5 PCoA analysis

    圖6 差異性矩陣熱圖Figure 6 Differential matrix heat map

    3 討論

    微生物的多樣性及結(jié)構(gòu)研究是進(jìn)行復(fù)雜微生態(tài)系分析的基礎(chǔ),通過分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道中微生物的豐度與結(jié)構(gòu),能夠揭示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道疾病發(fā)生與微生物群落之間的關(guān)系,從而為預(yù)防和治療腸道疾病提供合理的理論依據(jù)[7]。

    早期的研究實(shí)驗(yàn)小鼠腸道正常菌群主要菌屬有雙歧桿菌、擬桿菌(類桿菌)、腸球菌、乳桿菌、梭桿菌、真桿菌[8]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,本研究中實(shí)驗(yàn)小鼠、大鼠腸道菌群共分成63個(gè)屬,其中擬桿菌屬的含量最高,其次為Hungatella、副桿狀菌屬、乳酸桿菌屬、Mucispirillum、Ruminiclostridium、Akkermansia、羅氏菌屬。而在人腸道中較為常見的柔嫩梭菌屬、真桿菌屬等菌屬在本研究小鼠、大鼠腸道中并未發(fā)現(xiàn)[9]。李偉等[10]對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠腸道總菌群進(jìn)行多樣性比較研究,結(jié)果顯示種間腸道菌群存在差異,種內(nèi)雌雄個(gè)體之間并沒有顯著的差異,與本研究中同種品系雌雄間腸道菌群無(wú)明顯差別一致。

    從門水平看,實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠腸道菌群以擬桿菌門和厚壁菌門占據(jù)主要地位,其次為脫鐵桿菌門、變形菌門、疣微菌門、無(wú)壁菌門、放線菌門和梭桿菌門;大小鼠與人腸道菌群相比較則存在多數(shù)門交叉,總體組成較為接近,都以硬壁菌門和擬桿菌門占據(jù)優(yōu)勢(shì);但也有部分門不相同,如小鼠和大鼠有脫鐵桿菌門和無(wú)壁菌門,人有藍(lán)菌門、螺旋體門和Vadin BE97門[11]。最近有對(duì)樹鼩大腸菌群的研究顯示,樹鼩的腸道菌群同樣具有豐富的多樣性,以厚壁菌門和變形菌門的豐度最高[12]。也有研究表明不同飲食對(duì)同一鼠種腸道菌群多樣性存在差異,同種飲食干預(yù)對(duì)不同品系鼠種腸道菌群多樣性的影響也存在差異,但不同飲食結(jié)構(gòu)的大小鼠均以擬桿菌門和厚壁菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌群[6]。

    本研究結(jié)果顯示,不同來(lái)源設(shè)施對(duì)動(dòng)物腸道菌群多樣性的影響較大, Alpha多樣性分析顯示ZY的物種豐富度明顯低于DJ和SY,Beta多樣性分析也說明相同來(lái)源動(dòng)物的菌群組成相似性較高;同時(shí)品系對(duì)菌群相似性也有所影響,如DJ-1~DJ-3、DJ-11~DJ-14、SY-1~SY-3品系內(nèi)相似度較高。因此,不同來(lái)源設(shè)施的飼養(yǎng)環(huán)境是動(dòng)物腸道菌群多樣性的主要影響因素,品系對(duì)腸道菌群多樣性也有一定影響。

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