沉默Wnt4基因抑制大鼠腎間質(zhì)纖維化

楊陽，白海濤*，李玲，陳美雪

(1. 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院兒內(nèi)科，福建 廈門 361000； 2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院兒內(nèi)科， 武漢 430014； 3. 莆田市兒童醫(yī)院兒內(nèi)科，福建 莆田 351100)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是慢性腎病的病理生理基礎(chǔ)。RIF是由于各種原因使間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc, ECM)不斷積聚從而導(dǎo)致腎功能減退的動(dòng)態(tài)過程。而腎小管上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)作為腎小管間質(zhì)纖維化的主要細(xì)胞學(xué)行為，近年來已被廣為接受和研究，但其確切分子機(jī)制尚未完全闡明。Wnt/β-catenin信號通路被越來越多證實(shí)與纖維化疾病的發(fā)生密切相關(guān)，包括特發(fā)性肺纖維化、肝纖維化等。Wnt基因家族目前已有19種基因，16種在成年小鼠腎有不同程度表達(dá)。其中Wnt4基因在腎的發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在胚胎腎中，Wnt4主要誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)腎小管的形成。Wnt4基因沉默是否通過參與EMT過程，延緩腎間質(zhì)纖維化，目前相關(guān)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尚未見報(bào)道。本研究通過構(gòu)建Wnt4-siRNA載體分別轉(zhuǎn)染UUO大鼠體內(nèi)，擬在探討Wnt4基因沉默后對β-catenin表達(dá)的影響,以及與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠128只，7周齡，體重約180 ～ 220 g，由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(京)2012-0001】，實(shí)驗(yàn)在廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行【SYXK(閩)2013-0006】。SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照黑暗交替12/12 h，建模前12 h禁食。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 試劑與儀器

慢病毒載體系統(tǒng)(載體編號：GV115)、293T細(xì)胞、大腸埃希菌菌株DH5α、PCR 用試劑primer(R&F)購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。兔抗大鼠α-SMA單克隆抗體購自英國Abcam，兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體購自杭州賢至生物科技公司。山羊抗兔二抗購自美國Earthox。兔抗大鼠Wnt4多克隆抗體、兔抗大鼠β-catenin單克隆抗體、兔抗大鼠 vimentin單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司。兔IgG兩步法免疫組化試劑盒即用型購自武漢博士德。Taq polymerase、TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒和RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成。DMEO購自Gibco公司，胰酶購自上?；瘜W(xué)試劑公司，Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。oligo dT購自上海生工，PVDF膜購自美國PALL，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自北京天根生化，DAB顯色盒購自福州邁新生物技術(shù)公司，X光膠片購自美國Kodak，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1Wnt4 siRNA慢病毒載體的構(gòu)建

選取NRK-52E大鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)，收集生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，采用RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)，篩選出表達(dá)豐度較高的細(xì)胞類別，用做后期的慢病毒的內(nèi)篩內(nèi)驗(yàn)。根據(jù)目的基因序列及siRNA設(shè)計(jì)原則，分別設(shè)計(jì)四個(gè)Wnt4基因的干擾靶點(diǎn)。構(gòu)建病毒載體框架。(見表1)。

通過T4DNA連接酶將雙酶切(酶切位點(diǎn)為AgeI，EcoRI)線性化的載體和DNA片段在適當(dāng)?shù)腷uffer 中進(jìn)行連接反應(yīng)，制備雙鏈DNA oligo，連接與轉(zhuǎn)化慢病毒載體(pGCSIL-GFP載體)與Wnt4 shRNA序列。挑取轉(zhuǎn)化子重懸于10 μL LB溶液，混勻取1 μL作為模板；使用相應(yīng)引物：Wnt4上游上游引物CCATGATTCCTTCATATTTGC；下游引物GTAATACGGTTATCCACGCG。進(jìn)行菌落PCR鑒定實(shí)驗(yàn)。PCR陽性重組子鑒定后，送公司測序。包裝Wnt4 siRNA慢病毒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

表1 Wnt4基因shRNA序列Table 1 Wnt4 shRNA sequences

1.2.2 動(dòng)物模型制作

180 ～ 220 g的雄性SD大鼠稱重后以1%的戊巴比妥鈉注射麻醉后，固定于動(dòng)物臺(tái)，備皮后醫(yī)用酒精及安爾碘常規(guī)消毒，行左側(cè)恥骨上切口(約2 ～ 3 cm),逐層打開腹腔，推開腸管避開肝，沿左腎下極尋找左輸尿管，游離，用5-0號絲線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管以防逆行性感染，分層縫合切口并安爾碘消毒；假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸尿管，并不結(jié)扎，其余步驟同單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction, UUO) 模型組。

1.2.3 動(dòng)物分組及體內(nèi)轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)設(shè)128只SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：根據(jù)手術(shù)及給藥處理方式的不同，依次為①假手術(shù)組(單側(cè)輸尿管分離不接扎組，n=32)；②模型組(UUO組，單側(cè)輸尿管結(jié)扎組，n=32)；③陰性組(單側(cè)輸尿管結(jié)扎+陰性慢病毒液沉默組，n=32)；④沉默組(單側(cè)輸尿管結(jié)扎+Wnt4慢病毒液沉默組，n=32)。于術(shù)后第3、7、10、14天每組各處死8只動(dòng)物，留取腎標(biāo)本。其中陰性組在UUO模型組的基礎(chǔ)上用微量進(jìn)樣器于腎被膜(單側(cè)腎轉(zhuǎn)染)下注射陰性對照的重組慢病毒液10 μL(含病毒顆粒1×107ifu)，沉默組在UUO組的基礎(chǔ)上采用微量進(jìn)樣器于腎被膜下注射特異的Wnt4 siRNA慢病毒液10 μL。四組大鼠自由取食并飲水。分別于術(shù)后3、7、10、14 d犧牲各組8只大鼠，取腎組織。

1.2.4 冰凍切片制作、標(biāo)本采集

注射慢病毒液的梗阻側(cè)腎組織必須保持新鮮，勿固定，立即制作冰凍切片。Wnt4 siRNA慢病毒濃縮液腎內(nèi)轉(zhuǎn)染3 d后犧牲大鼠，立即取梗阻側(cè)腎，勿固定，用干凈凍存管裝好。將組織塊置于金屬組織托上面，組織塊在-15℃ ～ -20℃環(huán)境中冰硬，切片厚度為4 ～ 5 μm。切片置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光在腎的分布，了解不同劑量組的感染效率。

各組大鼠分別于造模后3、7、10、14 d犧牲大鼠,并取左側(cè)腎，冠狀面切開組織，取一部分腎組織(小米粒大小，約1 mm3)置于2.5%戊二醛中固定，待做電鏡。一部分置于4% 中性甲醛中固定，石蠟包埋，待做H&E染色、Masson染色及免疫組化。一部分剝離表面脂肪后分離腎皮質(zhì)和髓質(zhì)，包入無菌錫紙中置液氮罐內(nèi)，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，待做RT-PCR。

1.2.5 H&E染色病理檢測β-catenin、Wnt4、E-cadherin和α-SMA的表達(dá)

按常規(guī)方法進(jìn)行H&E染色，光鏡下觀察四組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)病理及腎間質(zhì)纖維化的改變。按說明書采用兔IgG兩步法免疫組化法染色，結(jié)果以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。

1.2.6 RT-PCR檢測β-catenin、Wnt4、E-cadherin和α-SMAmRNA的表達(dá)

取各組轉(zhuǎn)染后3、7、10、14 d 大鼠腎皮質(zhì)100 mg，采用Trizol試劑提取大鼠腎皮質(zhì)RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。經(jīng)37℃，15 min，85℃ 5 s，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板用相應(yīng)引物經(jīng)PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)計(jì)α-SMA、β-catenin、Wnt4引物，以GAPDH作為內(nèi)參，以目的基因拷貝數(shù)/GAPDH 拷貝數(shù)作為目的基因的相對表達(dá)量。擴(kuò)增條件為：95℃ 預(yù)變性30 s；95℃ 變性15 s，58℃退火20 s、72℃ 20 s，共45 個(gè)循環(huán)。融解曲線條件：95℃ 5 s，65℃ 1 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎間質(zhì)病理H&E染色結(jié)果

H&E染色結(jié)果表明：假手術(shù)組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)未見腎間質(zhì)改變；UUO組、陰性沉默組及沉默組造模后3 d出現(xiàn)腎間質(zhì)水腫、少量腎間質(zhì)纖維化，10、14 d腎間質(zhì)彌漫性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，呈加重趨勢；陰性沉默組基因與UUO組相同；沉默組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)不同程度腎間質(zhì)纖維化，14 d腎間質(zhì)纖維化程度低于陰性沉默組及UUO組(P< 0.05)(圖1)。

2.2 Wnt4基因沉默后Wnt4 mRNA相對表達(dá)量

假手術(shù)組Wnt4 mRNA表達(dá)量在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯變化；UUO組及陰性組Wnt4 mRNA表達(dá)量隨著阻斷時(shí)間延長增加，與同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組相比明顯增多(P< 0.05)，第10、14天明顯低于同一時(shí)間點(diǎn)的UUO組及陰性沉默組(P< 0.05)(圖2)。

圖1 Wnt4基因沉默后不同時(shí)間各組大鼠腎間質(zhì)H&E染色結(jié)果(×200)Figure 1 Pathological changes of renal interstitium of the rats in different groups at different time points after Wnt4 silencing(HE staining,×200)

注：b1表示UUO組、陰性沉默組與假手術(shù)組比較，P< 0.05；b2、b3表示沉默組與UUO組、陰性沉默組比較，P< 0.05。(下圖同)圖2 Wnt4基因沉默后腎組織中Wnt4 mRNA相對表達(dá)量Note. b1: The UUO and the negative silencing groups were compared with the sham operation group, respectively, P< 0.05. b2 and b3: The silencing group compared with the UUO and negative silencing groups, P < 0.05.(The same in the following figures)Figure 2 Relative expression of Wnt4 mRNA in the renal tissues after Wnt4 silencing

2.3 Wnt4基因沉默后β-catenin mRNA相對表達(dá)量

假手術(shù)組β-cateninmRNA的表達(dá)量在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯變化；UUO組、陰性組及沉默組β-cateninmRNA的表達(dá)量隨著梗阻時(shí)間延長增加，明顯高于同一時(shí)間點(diǎn)的正常組(P< 0.05)，且三組間表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(見圖3)

2.4 Wnt4基因沉默后α-SMA mRNA相對表達(dá)量

假手術(shù)組α-SMAmRNA表達(dá)量在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯差別；UUO組及陰性組α-SMAmRNA表達(dá)量隨著梗阻時(shí)間延長增加，明顯高于同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組(P< 0.05)。沉默組的α-SMAmRNA表達(dá)量隨著梗阻時(shí)間延長減少，第10、14天時(shí)與同一時(shí)間點(diǎn)的UUO組及陰性沉默組相比明顯減少(P< 0.05)，但仍明顯高于同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組(圖4)。

圖3 Wnt4基因沉默后β-catenin mRNA相對表達(dá)量Figure 3 Relative expression of β-catenin mRNA in the renal tissues after Wnt4 gene silencing

圖4 Wnt4基因沉默后α-SMA mRNA相對表達(dá)量Figure 4 Relative expression of α-SMA mRNA in the renal tissues after Wnt4 silencing

2.5 Wnt4基因沉默后波形蛋白(vimentin)mRNA相對表達(dá)量

假手術(shù)組的vimentinmRNA表達(dá)量在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯差異；UUO組及陰性沉默組vimentinmRNA表達(dá)量隨著梗阻時(shí)間延長增加，明顯高于同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組(P< 0.05)。沉默組vimentinmRNA表達(dá)量隨著梗阻時(shí)間延長增加，第14天時(shí)表達(dá)量減少，明顯低于同一時(shí)間點(diǎn)的UUO組及陰性沉默組(P< 0.05)，但較同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組表達(dá)量仍高(P< 0.05)(見圖5)。

圖5 Wnt4基因沉默后波形蛋白(vimentin)mRNA相對表達(dá)量Figure 5 Relative expression of vimentin mRNA after Wnt4 silencing

注：A、B,UUO組; C、D，沉默組。圖6 Wnt4基因沉默后Wnt4與β-catenin、α-SMA相關(guān)性分析Note.A、B,UUO group. C、D，Silencing group.Figure 6 Correlation between the expressions of Wnt4 and β-catenin and α-SMA after Wnt4 gene silencing

2.6 Wnt4基因沉默后Wnt4與β-catenin、α-SMA相關(guān)性分析

Wnt4基因沉默后UUO組 mRNA表達(dá)量的相關(guān)性分析顯示，Wnt4與β-cateninmRNA表達(dá)量具有顯著相關(guān)性(r=0.886，P< 0.001)(圖6A)。Wnt4與α-SMAmRNA表達(dá)量具有顯著相關(guān)性(r=0.930，P< 0.001)(圖6B)。Wnt4基因沉默后沉默組mRNA表達(dá)量的相關(guān)性分析顯示，Wnt4與β-cateninmRNA表達(dá)量無顯著相關(guān)性(r=0.204，P=0.263)(圖6C)。Wnt4與α-SMAmRNA表達(dá)量具有顯著相關(guān)性(r=0.753，P< 0.001)(見圖6D)。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是臨床慢性腎病治療和腎移植管理的關(guān)鍵，但至今RIF的發(fā)病機(jī)制還不甚明了，對抗腎間質(zhì)纖維化的治療，尚無有效的方案。本研究前期實(shí)驗(yàn)證明Wnt/β-catenin信號通路在腎間質(zhì)纖維化中起到重要作用，信號通路阻斷可減少腎間質(zhì)纖維化發(fā)生。Wnt信號傳導(dǎo)通路分為經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路及非經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，后者包括Wnt/Ca2+通路和細(xì)胞極性通路[1]，當(dāng)腎損傷時(shí)，Wnt4基因大量表達(dá)，與跨膜結(jié)合并形成復(fù)合物，抑制細(xì)胞內(nèi)GSK-3β表水平達(dá)，阻止β-連環(huán)蛋白磷酸化及降解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-連環(huán)蛋白大量聚集，進(jìn)入細(xì)胞核中與轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF 結(jié)合，激活下游與EMT密切相關(guān)的靶基因，包括Snail,TwistT和鋅指蛋白(zinc finger E-box binding protein, ZEB)，三者均可在抑制上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的同時(shí)激活間充質(zhì)基因，包括N-鈣粘蛋白、波形蛋白和粘連蛋白[2-3]。在腎發(fā)育的不同階段，多種Wnt蛋白在腎不同部位均有不同程度的表達(dá)。國內(nèi)外大量的基因敲除模型及體外研究證實(shí)，WNT蛋白介導(dǎo)的信號通路在腎的發(fā)育過程中必不可少，在腎發(fā)育的早期，Wnt4主要表達(dá)腹側(cè)間充質(zhì)帽(CM)中，介導(dǎo)間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)分化，是唯一在腎前體細(xì)胞表達(dá)并表現(xiàn)出在腎發(fā)育過程中有重要作用的Wnt基因[4]。關(guān)于Wnt4誘導(dǎo)MET發(fā)生的機(jī)制，2011年，Tanigawa等[5]用重組WNT蛋白作為大鼠后腎間充質(zhì)的祖細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)WNT4 蛋白能夠誘導(dǎo)腎小管的形成。2013年，李里等[6]應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組質(zhì)粒pEGFP-PAX2轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PAX2轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞后激活了Wnt4 通路，PAX2在體外誘導(dǎo)正常腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化可能是通過 Wnt/β-catenin通路完成。綜上所述，Wnt4基因和β-catenin基因及其編碼的蛋白在Wnt/β-catenin信號通路對EMT的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

本研究成功制作UUO大鼠RIF 模型，并通過慢病毒轉(zhuǎn)染成功將Wnt4-siRNA片段導(dǎo)入U(xiǎn)UO 大鼠體內(nèi)，同時(shí)應(yīng)用Real-Time PCR 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)Wnt4 基因沉默組與陰性對照組比較，Wnt4 mRNA 和蛋白表達(dá)量明顯降低，提示W(wǎng)nt4基因被沉默。在UUO模型中，Wnt4基因隨著梗阻時(shí)間延長表達(dá)量增加明顯，與轉(zhuǎn)分化指標(biāo)α-SMA的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.930，P< 0.01)，纖維化指標(biāo)波形蛋白梗阻后表達(dá)量增加，且腎病理提示腎間質(zhì)膠原纖維堆積，纖維化形成，證實(shí)Wnt4基因被大量激活后，參與腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化形成。β-連環(huán)蛋白在梗阻后第7天表達(dá)量明顯增多，明顯高于同期的假手術(shù)組，且Wnt4與β-catenin的mRNA相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.886，P< 0.001)，說明Wnt4沉默后，主要通過Wnt4/β-catenin信號通路傳導(dǎo)信號，誘導(dǎo)腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的發(fā)生。沉默組的β-cateninmRNA的表達(dá)量隨著梗阻時(shí)間的延長表達(dá)量增加，與同一時(shí)間點(diǎn)的UUO組及陰性組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且相關(guān)性分析結(jié)果顯示W(wǎng)nt4與β-catenin無顯著相關(guān)性(r=0.204，P=0.263)，提示W(wǎng)nt4基因沉默后，可能會(huì)代償性地激活其他信號通路，導(dǎo)致β-catenin的表達(dá)量上調(diào)。在轉(zhuǎn)染10 d 時(shí)，靶基因沉默組α-SMAmRNA 表達(dá)量明顯低于陰性對照組。說明Wnt4基因沉默在纖維化進(jìn)程中對EMT 有影響，在纖維化進(jìn)程中可明顯抑制腎小管EMT的過程，延緩RIF的進(jìn)程。本研究顯示在UUO模型中β-連環(huán)蛋白在梗阻后第7天表達(dá)量明顯增多，明顯高于同期的正常組，且Wnt4與β-catenin的mRNA相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.886，P< 0.001)，說明Wnt4基因激活后，主要通過Wnt4/β-catenin信號通路傳導(dǎo)信號，誘導(dǎo)腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的發(fā)生。

Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究還處于探索階段，有許多問題尚不清楚。本研究通過沉默Wnt/β-catenin信號通路中的Wnt4基因，觀察了腎間質(zhì)纖維化的改變，發(fā)現(xiàn)沉默Wnt4 基因后腎間質(zhì)纖維化減少。腎間質(zhì)纖維化是由多因素導(dǎo)致、多基因參與、多步驟形成的復(fù)雜病理生理過程。選擇合適的藥物和有效的治療手段對于慢性腎病患者至關(guān)重要。綜上所述，本研究為慢性腎病的藥物研發(fā)及治療靶點(diǎn)提供了一定的理論依據(jù)。