減蛋綜合征病毒在不同品系小鼠體內的組織分布

范濤，梁琳，李嘉陽，李剛*

(1. 中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2. 中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

減蛋綜合征病毒(egg drop syndrome virus, EDSV)屬禽類腺病毒，2005年國際病毒分類委員會(ICTV)新的腺病毒分類標準中將EDSV歸為富AT腺病毒屬[1]。該病毒主要引起禽類(雞、鴨、鵝等)產蛋量急劇下降，可在鴨胚細胞、鴨胚成纖維細胞中良好增殖，而在雞胚成纖維細胞中增殖不良，以鴨為自然宿主[2]，也稱為鴨腺病毒A型。

腺病毒具有宿主范圍廣，致病性低，外源基因承載量大等特點，可作為抗原基因載體制成疫苗，誘導固有免疫反應或在宿主細胞內表達承載基因產物，進而實現(xiàn)免疫預防或治療目的。禽腺病毒憑借種屬的差異，對哺乳動物來說有很好的安全性，已成為重要的疫苗載體并得到廣泛的應用[3-5]，研究較早且具有代表性的毒種是雞胚致死孤兒病毒(CELOV)，而EDSV是否具備同樣的效果仍需進行實驗證實。本研究選用了3個品系小鼠模型作為對象，通過人工感染，觀察EDSV在小鼠體內增殖情況以及動態(tài)變化規(guī)律，為該病毒構建載體提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

免疫系統(tǒng)正常小鼠BALB/c、T細胞免疫缺陷小鼠Nu、高度免疫缺陷小鼠NSG，每個品系32只，SPF級，雌性，5 ～ 6周齡，體重為14 ～ 16 g，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所保存并提供【SCXK(京)2014-0013】。動物飼養(yǎng)在中國食品藥品檢定研究院動物實驗室屏障環(huán)境隔離器中【SYXK(京)2016-0004】。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22 ～ 26℃，相對濕度40%～70%，壓差≥50 Pa，換氣次數(shù)≥ 20 次/h，空氣潔凈度5級，明暗交替12/12 h，噪聲≤60 dB。同時本實驗在中檢院實驗動物倫理委員會監(jiān)督與指導下進行【中檢動(福)第2016(B)007號】。

1.1.2 主要儀器

隔離器(蘇州馮氏實驗動物設備有限公司軟包隔離器，中國)，離心機(Beckman X-22R，德國)，超速離心機(Hitachi CP100NX，日本)；紫外分光光度儀(Thermo Nano Drop 2000，美國)；酶標儀(Thermo Fisher Multiskan Go，美國)；恒溫培養(yǎng)箱(上海智城ZXMP-A1230，中國)；熒光定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司ABI 7500 Fast，美國)；單通道(2 ～ 20 μL、20 ～ 200 μL)、八通道(50 ～ 300 μL)微量移液器(Eppendorf，德國)。

1.1.3 主要試劑耗材

ELISA 96孔可拆式(8×12)聚苯乙烯酶標板(NUNC公司，丹麥)，0.1 mL八聯(lián)排管及八聯(lián)排管超凈光蓋(BIO plastics BV，荷蘭)；TaKaRa Premix Ex Taq 試劑、蛋白酶K、RNase A(寶生物工程(大連)有限公司，中國)，乙醇、飽和酚、氯仿、異丙醇等(北京化學工業(yè)集團有限公司，中國)；蔗糖密度梯度溶液、1×PBS、抗原包被液、封閉液、PBST洗液、抗體稀釋液、酶結合物稀釋液、TMB顯色劑、終止液等由實驗室自行配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠攻毒與樣本采集

將EDSV病毒液室溫解凍，搖勻。3個品系小鼠，品系內分為實驗組24只，每只小鼠腹腔注射0.1 mL血凝效價為212的病毒液；對照組8只，每只腹腔注射同等劑量的PBS。實驗組與對照組分開放置于不同隔離器內飼養(yǎng)。分別于攻毒后1、3、5、7、14、21、28、35 d，每日選取各品系3只實驗組和1只對照組小鼠，CO2麻醉，摘除眼球取全血約1 mL，置于1.5 mL離心管中，4℃靜置析出血清，用微量移液器吸取上層血清至新離心管中，編號，-20℃凍存?zhèn)溆?。選擇攻毒后1、7、14、21、28 d實驗組與對照組小鼠，剖取心臟、肺、肝、脾、腎、小腸、子宮、氣管、食管、腦10種組織，每種組織取一小塊置于1.5 mL離心管中，用于DNA提取，-80℃凍存。

1.2.2 間接ELISA抗原包被濃度與抗體稀釋度優(yōu)化

30% ～ 50%(m/v)5個間隔相等濃度梯度的蔗糖溶液進行超速離心純化抗原；用純化的EDSV抗原包板，抗原稀釋為2、5、7、10 μg/mL 4個濃度，取已知陽性血清、陰性血清各1份，分別做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600倍的稀釋，“方陣滴定法”確定抗原最佳包被濃度與血清工作稀釋度，P/N值最大時對應的抗原濃度與抗體稀釋度為工作濃度。

1.2.3 間接ELISA方法小鼠血清抗體監(jiān)測

用優(yōu)化后濃度的抗原液包板，100 μL/孔，37℃ 1 h后4℃過夜；設置陰性對照、陽性對照、空白對照各2個孔，分別加入工作濃度稀釋后的SPF級小鼠血清、已知EDSV抗體陽性小鼠血清和PBS，待檢血清樣本稀釋后每份平行做2孔，每孔100 μL，用封板膜封板，37℃反應1 h；取出后洗板5次，叩干；山羊抗鼠辣根過氧化物酶(goat anti-mouse IgG-HRP)按1∶5000稀釋為工作濃度，每孔加入100 μL，封板，37℃孵箱反應1 h，取出后洗板5次并叩干；每孔加入100 μL 底物溶液，放入鋁箔袋，37℃避光顯色10 ～ 15 min；取出酶標板，每孔加入50 μL終止液(2 mol/L硫酸)；酶標儀設定波長為450 nm，讀取板上各孔OD值。

1.2.4 TaqMan qPCR檢測EDSV體內組織分布

將各組織塊解凍，剪碎，飽和酚/氯仿法提取總DNA，紫外分光光度計測定DNA濃度及純度。以EDSV六鄰體蛋白編碼區(qū)基因序列作為目的基因，文獻獲得探針引物[6]；NCBI網站公布的小鼠β-actin蛋白(Actb)基因序列(Gene ID：11461)為內參基因，設計探針引物，由寶生物工程(大連)有限公司設計合成。(表1)

根據(jù)TaKaRa Premix Ex Taq 試劑使用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀推薦反應體系及條件進行擴增，qPCR反應體系：PremixExTaq(2×buffer) 10 μL、Forward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL、Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL、Probe (5 μmol/L) 0.8 μL、ROX Reference Dye2 (50×) 0.2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6.2 μL，qPCR反應程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)，60℃時收集熒光信號。用比較CT法(△△CT)進行數(shù)據(jù)處理，得出相對定量(RQ)值，再將RQ值取10的對數(shù)(LgRQ)，轉換為數(shù)量級的形式來判斷變化量[7]。

表1 EDSV、Actb 熒光定量PCR引物及探針Table 1 Primers and probes for EDSV, Actb TaqMan qPCR

2 結果

2.1 間接ELISA檢測三種小鼠血清抗體變化規(guī)律

2.1.1 抗原包被濃度與抗體稀釋度優(yōu)化

“方陣滴定”結果顯示，EDSV抗原包被濃度為2 μg/mL，陰性、陽性血清稀釋度為1∶800倍時，此時的P/N值最高，為23.10，因此，確定使用該濃度的抗原及血清稀釋度進行抗體檢測。(表2)

表2 EDSV抗原包被濃度及血清工作稀釋度結果Table 2 Results of EDSV coating concentration and serum working dilution

2.1.2 間接ELISA監(jiān)測三種小鼠血清抗體

ELISA檢測結果顯示(表3)，BALB/c小鼠攻毒3 d即可在血清內檢測到抗體的表達，平均OD值為0.901；至14 d，抗體水平達到最高，至監(jiān)測期內35 d一直維持高水平表達；Nu小鼠也可于攻毒3 d檢測到抗體，但表達水平較BALB/c小鼠有所降低，平均OD值為0.587，攻毒14 d后，Nu小鼠血清中抗體水平出現(xiàn)下降，至35 d抗體一直維持在較低的水平；NSG小鼠在整個監(jiān)測過程中，抗體水平一直處于陰性狀態(tài)。根據(jù)檢測數(shù)據(jù)，繪制三品系小鼠血清抗體變化趨勢圖(圖1)。

表3 三品系小鼠血清抗體ELISA檢測結果Table 3 ELISA test results of serum antibodies in the three mouse strains

圖1 三品系小鼠血清抗體ELISA檢測結果比較Figure 1 Comparison of ELISA results of serum antibodies in the three mouse strains

2.2 TaqMan qPCR檢測EDSV組織分布結果

3個品系小鼠的10種組織樣本，除NSG小鼠7 d和14 d腦組織中未檢測到病毒含量外，其他樣本目的基因與內參基因均可計算出相對表達量(表4)。同時，各品系對照組小鼠在實驗期內，各組織中均未擴增出病毒核酸。

根據(jù)實驗結果，BALB/c小鼠感染后1 d，肝組織中的病毒表達量最高，達到5.45個數(shù)量級，其次由高到低依次是脾、食管、子宮、小腸、肺、氣管、腎、心臟，腦組織中病毒含量最低，隨感染時間的延長，各組織內病毒表達量較感染1 d均有所下降；至攻毒后28 d，肝、脾病毒表達量依然維持著較高的水平，腦組織中病毒相對含量降至最低，其他各臟器組織中仍可檢測到病毒含量(圖2)。

Nu小鼠和NSG小鼠略有差異，其感染1 d表現(xiàn)為脾組織中病毒表達量最高，分別為3.95和4.05個數(shù)量級，其次為肝，Nu小鼠1 d肝病毒含量為3.84個數(shù)量級，NSG小鼠為3.82個數(shù)量級。隨后兩品系小鼠各器官內的病毒表達量逐步降低，以Nu小鼠最為明顯，于攻毒28 d，兩種小鼠體內各器官內仍可以檢出陽性信號，肝、脾病毒表達量較高。結果表明，在監(jiān)測期內，EDSV可在部分小鼠組織器官內始終存在，主要集中在肝、脾等組織中(圖3、圖4)。

表4 三品系小鼠各組織病毒載量相對定量結果Table 4 Relative quantitative results of viral load in tissues of the three mouse strains

圖2 EDSV在BALB/c小鼠體內組織分布Figure 2 Organ distribution of EDSV in the BALB/c mice

圖3 EDSV在Nu小鼠體內組織分布Figure 3 Organ distribution of EDSV in the nude mice

圖4 EDSV在NSG小鼠體內組織分布Figure 4 Organ distribution of EDSV in the NSG mice

3 討論

EDSV按原分類屬于禽類腺病毒Ⅲ群，由五鄰體蛋白(penton)、六鄰體蛋白(hexon)與纖維蛋白(fiber)共同構成病毒衣殼。試驗證明，三種結構性蛋白基因經過重組表達鑒定，均具有免疫原性[8-10]。在EDSV感染禽類的研究中，種鴨可在攻毒3 d檢測到血清抗體，HI效價可達8 Log2，并于攻毒后12 d達到最高[11]；王曉東[12]對3月齡SPF鴨僅進行基礎免疫后，第1周即可檢測出血清抗體，平均HI效價5.75 Log2，兩周后達到最高6.75 Log2，抗體水平可維持17周在5 Log2以上。以上結果都指示出EDSV可快速刺激禽類機體產生免疫應答反應，并產生持久性的抗體保護。鼠腺病毒(mouse adenovirus, Mad)以小鼠為天然宿主，在實驗鼠群中感染比例約為8.3%[13]。人工感染后15 d ELISA方法可檢測出陽性血清抗體，37 d達到峰值[14]。本實驗是使用禽腺病毒人工感染小鼠，結果顯示，該病毒株可使小鼠在短期內產生較高水平的抗體，并且可維持35 d抗體持續(xù)檢出，相比鼠腺病毒，EDSV能夠較快地刺激小鼠機體產生免疫應答反應，與禽類感染此病毒后的特性相一致。

通過實驗結果可以看出，動物自身免疫機能對EDSV抗體的表達產生著影響。免疫機能正常的BALB/c小鼠，在抗原刺激后3 d即可檢測出血清抗體，并隨著感染時程延長，抗體水平逐漸增高，監(jiān)測至35 d，仍然保持著較高的抗體含量。裸小鼠較BALB/c而言，缺少胸腺，體內無成熟的T淋巴細胞，而EDSV像大多數(shù)微生物一樣屬胸腺依賴性抗原(TDAg)，輔助性T細胞(Th)的缺陷，導致小鼠體內B細胞在免疫應答過程中產生的抗體有所減少，不能持續(xù)產生有效的體液免疫應答。因此，裸鼠的血清抗體產生初期，表達水平較BALB/c小鼠偏低，監(jiān)測至21 d時，血清抗體水平下降明顯。NSG小鼠是在NOD小鼠背景基礎上，DNA修復復合蛋白Prkdc發(fā)生scid突變，致使小鼠B、T淋巴細胞缺失，同時IL2rg缺失突變，阻止了多重受體細胞因子信號傳導，導致功能性NK細胞缺失[15]，動物機體無法產生細胞免疫應答與體液免疫應答，因此，在整個抗原刺激過程中，其抗體水平一直維持在陰性，符合該模型特點。

應用熒光定量PCR相對定量法檢測病毒載量，其優(yōu)勢在于去除了采樣間的誤差，結果用變化倍數(shù)來表示，用于指示病毒在體內含量的變化趨勢。通過比較不同品系小鼠各組織臟器中病毒核酸相對表達量可以看出，三品系小鼠均可在腹腔注射病毒液后1 d于體內各主要臟器中檢測到病毒，這可能與感染途徑有關，病毒液隨血液循環(huán)迅速擴散至全身各臟器中。BALB/c小鼠感染后1 d，肝為病毒相對表達量最高的組織器官，感染至28 d，脾中病毒相對表達量最高，肝較脾中病毒水平略低，但依然顯示有較高的表達量；Nu和NSG兩種免疫缺陷型小鼠表現(xiàn)出攻毒后1 d脾病毒含量最，其次是肝，這可能與其具有的免疫缺陷特性有關，兩種小鼠的脾均小于免疫正常的小鼠，至28 d時，其二者肝中病毒相對表達量是各組織間最高的，由此說明，EDSV對小鼠肝與脾有一定的親嗜性。通過三品系小鼠攻毒全程監(jiān)測結果可以看出，28 d時體內各組織的病毒含量較攻毒1周內(1 ～ 7 d)均有所降低，說明動物機體自身對EDSV有一定的清除作用。病毒在免疫系統(tǒng)正常與免疫缺陷小鼠的體內均沒有引起明顯的組織病變，除了動物機體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用以外還可能與組織細胞表面結合受體有關。腺病毒有嚴格的種屬特異性，而EDSV又是介于禽類腺病毒與哺乳動物腺病毒的中間體[16]，推測該病毒在哺乳動物體內可以增殖表達，是否引起組織細胞發(fā)生病變需進一步進行實驗觀察。

綜上所述，減蛋綜合征病毒可刺激小鼠產生免疫應答，在免疫缺陷小鼠體內抗體水平表達量較低，該病毒在小鼠體內有肝、脾等組織嗜性特點，為EDSV構建新型載體以及在實驗動物模型上的進一步研究與應用提供了理論基礎與數(shù)據(jù)支持。