青蒿琥酯對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的神經(jīng)保護作用及細胞自噬的影響

羅思維, 李作孝

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，四川 瀘州 646000)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS) 是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥脫髓鞘疾病，其病因及發(fā)病機制尚未完全明確，可能與遺傳、免疫、炎癥、環(huán)境因素等多因素有關[1]。對MS的治療主要以激素沖擊或丙種球蛋白為主，且治療價格昂貴，不良反應較多。但許多研究證據(jù)表明MS的病因和治療目標并不是單一的，MS中不僅僅存在免疫系統(tǒng)的異常，還與自噬、凋亡、氧化應激、線粒體損傷、能量衰竭等有關[2]。青蒿琥酯是青蒿素的一種半合成衍生物, 對瘧疾的治療有顯著效果，能夠有效的透過血腦屏障[3]。青蒿琥酯除治療瘧疾外，對重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、免疫性肝炎等自身免疫性疾病也有治療作用[4-7]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是目前研究MS最常用的動物模型。已有研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能夠改善EAE大鼠臨床癥狀，抑制PGE2的表達，防止EAE發(fā)病[8]。青蒿琥酯還能抑制白細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移，改善實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠癥狀[9]。但目前國內外尚未發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對EAE動物模型細胞自噬的研究報道。因此本研究旨在通過青蒿琥酯干預EAE小鼠，進一步探討對EAE小鼠細胞自噬作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用8周齡48只雌性SPF級C57BL/6小鼠(18～20 g)，均購于重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司[SCXK(渝)2017-0001]，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學忠山動物房內[SYXK(川)2013-185]，保持實驗前適應性飼養(yǎng)1周，保持室溫24℃左右的恒溫環(huán)境，每12 h維持晝夜交替，保持小鼠生長環(huán)境清潔，整個實驗過程符合《實驗動物飼養(yǎng)和使用條例》，且經(jīng)西南醫(yī)科大學動物保護與使用機構委員會批準。

1.2 主要試劑

注射用青蒿琥酯(桂林南藥股份有限公司)，MOG35-55多肽(上海吉爾生化有限公司)，完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)，百日咳毒素(美國Sigma公司)，兔抗小鼠多克隆微管相關蛋白1輕鏈3B(LC2B)抗體(Abcam公司)，山羊抗兔HRP(Aspen公司)，luxol fast blue(LFB)染液試劑盒(Aspen公司)，卡介苗凍干粉(上海嘉楚生物工程有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組和EAE模型制作

將48只雌性C57BL/6小鼠隨機分為空白組、模型組、青蒿琥酯低劑量組、高劑量組共4組，每組12只。參照Feng等[10]和許夢雪等[11]方法進行EAE造模，將5 mg MOG35-55溶于1 mL 生理鹽水中，卡介苗溶于完全弗氏佐劑中，濃度為10 g/L。將上述2種液體1∶1混合成誘導乳化劑。用1 mL注射器分別在模型組、低劑量組、高劑量組小鼠背部皮下注射誘導乳化劑0.1 mL(左右背側各0.05 mL)制作EAE模型，空白組注射等量生理鹽水。在造模當日及2 d后，于造模小鼠分別腹腔注射0.5 mL百日咳菌稀釋液增強免疫，空白組注射等量生理鹽水。造模后根據(jù)小鼠的一般情況觀察及神經(jīng)功能評分增加判斷EAE模型建立成功[12]。根據(jù)小鼠發(fā)病情況將造模成功小鼠納入了實驗[13]。

1.3.2 藥物干預方法

低劑量組和高劑量組從造模當日開始分別腹腔注射劑量為10 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)的青蒿琥酯，每日1次，連續(xù)10 d?？瞻捉M和模型組每日腹腔注射等劑量生理鹽水。由于目前國內外在青蒿琥酯對EAE的作用機制研究較少，本實驗低濃度、高濃度標準基于黃蕾等[8]和Thome等[9]研究，參照青蒿琥酯對類風濕性關節(jié)炎、自身免疫性肝炎的影響標準設立。

1.3.3 小鼠一般情況觀察

造模當日起由每天早上8:00對各組小鼠進行觀察，遵循雙盲原則，記錄小鼠發(fā)病潛伏期、進展期、高峰期、體重變化、毛發(fā)光澤及根據(jù)Weaver’s15分評分法[14]進行神經(jīng)功能評分。評分細則如下：尾巴無癥狀計0分，尾巴張力減低或尾巴遠端癱瘓計1分，尾巴全癱計2分；四肢無癥狀計0分，步態(tài)不穩(wěn)計1分，肢體輕癱、行走時肢體搖曳計2分，肢體全癱、行走時肢體外翻計3分；尾部和四肢的評分相加得總分，若出現(xiàn)死亡計15分。

1.3.4 動物處死及標本采集

各組于發(fā)病高峰期處死(神經(jīng)功能評分連續(xù)三天無變化為高峰期)[15]，空白組觀察至28 d[16]。取小鼠腦組織、頸膨大、腰膨大放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。制作病理切片的小鼠，?jīng)麻醉后，固定四肢，暴露心臟，剪開右心耳，將注射器針頭置于左心室中，緩慢灌注生理鹽水至肝臟發(fā)白，然后灌注4%多聚甲醛進行內固定，致小鼠全身僵硬時取出腦組織置于4%多聚甲醛中24 h進行外固定。

1.3.5 LFB染色

取腦組織側腦室周圍組織常規(guī)石蠟切片，片厚6 μm，將石蠟切片脫蠟，放入95%乙醇中5 min進行醇化，然后放入LFB染液中60℃水浴24 h，分化，封片。

1.3.6 Western blot檢測LC3-I、LC3-II表達情況

將腦白質、頸膨大、腰膨大加入裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，加入LC3、GAPDH一抗4℃過夜，回收已稀釋的一抗，用TBST洗三次，每次5 min，加入山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min，用TBST在室溫下?lián)u床上洗四次，每次5 min，滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)?，暗室中曝光，根?jù)不同的光強度調整曝光條件，顯影、定影，采用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 小鼠發(fā)病情況

2.1.1 小鼠一般情況

EAE小鼠造模成功表現(xiàn)為精神萎靡、飲食活動減少、毛發(fā)光澤度降低、體重減輕，此后逐漸加重出現(xiàn)尾部下垂、步態(tài)不穩(wěn)、后肢行走無力、甚至癱瘓，神經(jīng)功能評分大于0分。

空白組小鼠未見發(fā)病。模型組、青蒿琥酯低劑量組、高劑量組小鼠中出現(xiàn)不同嚴重程度的尾部下垂、步態(tài)不穩(wěn)、后肢行走無力、甚至癱瘓，神經(jīng)功能評分增加，發(fā)病率分別為83.3%，83.3%，75%，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組均未出現(xiàn)小鼠死亡。

2.1.2 發(fā)病潛伏期、高峰期及神經(jīng)功能評分比較

青蒿琥酯各劑量組發(fā)病潛伏期、高峰期較模型組均有延長(P<0.01)；高劑量組小鼠潛伏期較低劑量組延長(P<0.01)；高劑量組小鼠高峰期較低劑量組延長，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。青蒿琥酯各劑量組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能評分均低于模型組(P<0.01)，高劑量組評分低于低劑量組(P<0.05)。(如表1所示)

表1 模型組及各劑量組發(fā)病潛伏期、高峰期、高峰期神經(jīng)功能障礙評分比較

注：與模型組比較，aP<0.01；發(fā)病潛伏期與青蒿琥酯低劑量組比較，bP<0.01；高峰期神經(jīng)功能障礙評分與青蒿琥酯低劑量組比較，cP<0.05。

Note. Compared with the model group,aP< 0.01. Compared with the low-dose artesunate group in the latent period,bP< 0.01. Compared with the low-dose artesunate group in terms of neurodysfunction scores,cP< 0.05.

2.2 Luxol fast blue (LFB) 染色情況

LFB染色觀察各組小鼠腦組織病理改變情況?？瞻捉M小鼠腦組織LFB染色髓鞘結構清晰，未出現(xiàn)脫髓鞘情況(圖1A)。模型組、青蒿琥酯低劑量組、高劑量組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的脫髓鞘，髓鞘結構排列稀疏、紊亂，可見不同程度低染區(qū)域及空泡狀結構(圖1B-D)，青蒿琥酯治療組小鼠腦組織脫髓鞘情況較模型組輕。(如圖1所示)

表2 各組LC3I、LC3II、LC3II/LC3I光密度值比較(n=5)

注：與空白組比較，aP<0.01；為與模型組比較，bP<0.01；與青蒿琥酯低劑量組比較，cP<0.05。

Note. Compared with the control group,aP<0.01. Compared with the model group,bP<0.01. Compared with the low-dose artesunate group,cP<0.05.

注：A為空白組；B為模型組；C為低劑量組；D為高劑量組。圖1 各組小鼠腦組織LFB染色情況Note. A， Control group. B， Model group. C， Low-dose artesunate group. D， high-dose artesunate group.Figure 1 Demyelization in the brain tissues of mice in different groups(Luxol fast blue staining)

2.3 Western blot檢測結果

模型組較空白組比較，LC3-I、LC3-II條帶光密度值均增加，LC3-II/LC3-I比值也增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；青蒿琥酯各劑量組與模型組比較，LC3-I、LC3-II條帶光密度值均減小，LC3-II/LC3-I比值也較小，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，高劑量組較低劑量組作用明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(如圖2、表2所示)

圖2 各組Western blot檢測LC3I、LC3II表達情況Figure 2 Western blot analysis showing the expressions of LC3-I and LC3-II in the mice

3 討論

青蒿琥酯是青蒿素的主要衍生物之一，對于臨床各型瘧疾的治療效果顯著，同時也有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗纖維化、免疫調節(jié)等作用，其價格便宜、不良反應輕，有很多潛在的應用價值[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對多種自身免疫性疾病具有治療作用[4-7]。但目前青蒿琥酯對EAE動物模型的研究較少，國內外各只有一篇文獻報道。黃蕾等[8]研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠改善EAE大鼠臨床癥狀，抑制PGE2的表達，防止EAE發(fā)病。Thome等[9]研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯還能抑制白細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移。本實驗結果顯示，青蒿琥酯對EAE小鼠具有神經(jīng)保護作用，能夠延遲小鼠發(fā)病潛伏期、高峰期，改善神經(jīng)功能評分，這與黃蕾等研究結果一致。LFB染色結果顯示青蒿琥酯能夠改善腦組織髓鞘脫失情況，在國內外研究中是首次發(fā)現(xiàn)。

同時，青蒿琥酯還具有調節(jié)細胞自噬的作用。自噬紊亂可導致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病、亨廷頓病、帕金森病和肌萎縮側索硬化癥[10]。自噬是將細胞內變形、衰老或損傷的蛋白質和細胞器轉運到溶酶體腔中進行消化降解的一種普遍存在于真核生物的依賴溶酶體的降解過程，它實現(xiàn)了細胞內物質和能量的更新, 維持了蛋白質代謝平衡和細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[17-18]。Feng等[19]研究顯示青蒿琥酯能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路增強類風濕性關節(jié)炎大鼠滑膜細胞自噬水平。魯永玲等[20]研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能通過活性氧途徑增加小鼠巨噬細胞的自噬水平進而上調其殺菌活性。青蒿琥酯還能顯著抑制Burkitt淋巴瘤Raji細胞的增殖，誘導Raji細胞凋亡和自噬[21]。Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯通過自噬誘導乳腺癌細胞G2/m細胞周期阻滯，抑制腫瘤細胞生長。微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)是自噬標志物，分為胞質型(LC3I型)和自噬體膜型(LC3II型)，LC3I在自噬相關基因Atg7、Atg3的調控下轉化為LC3II，LC3II直接反應了自噬體的形成，LC3II/LC3I比例反映了自噬水平情況[23]。因此LC3I向LC3II生成障礙及自噬體降解受阻均會降低自噬水平。本實驗Western blot檢測結果與空白組相比，模型組腦脊髓組織LC3I、LC3II表達及LC3II/LC3I比值均上調，提示EAE小鼠腦脊髓組織存在細胞自噬異常。青蒿琥酯各劑量組較模型組相比，LC3I、LC3II表達及LC3II/LC3I比值均下調，高劑量組作用明顯，提示青蒿琥酯通過減輕細胞自噬作用發(fā)揮對EAE小鼠的神經(jīng)保護作用，在國內外研究中均是首次發(fā)現(xiàn)。但本實驗不足之處在于未進一步研究青蒿琥酯對于EAE小鼠細胞自噬的時序變化以及信號通路的影響，希望后續(xù)研究能進一步闡明相關機制，同時未能進一步研究區(qū)分神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞的自噬調控。且青蒿琥酯低濃度組和高濃度組發(fā)病高峰期數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義，可能與青蒿琥酯濃度組設置和樣本量較少有關。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對EAE小鼠具有神經(jīng)保護作用，其作用機制與下調LC3II/LC3I表達減輕細胞自噬有關，有望為臨床應用青蒿琥酯治療MS提供實驗理論基礎。