二甲雙胍與有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激的影響

馮麗潔，李 俊

(南京信息工程大學(xué)體育部，南京 210044)

血管并發(fā)癥是糖尿病致殘、致死的主要原因，動(dòng)脈粥樣硬化是引起血管并發(fā)癥的直接原因。研究顯示，氧化應(yīng)激在血管損傷及動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[1]。糖尿病狀態(tài)下高血糖和脂質(zhì)代謝紊亂對(duì)血管內(nèi)皮的損傷主要是通過(guò)氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的。因此，降低氧化應(yīng)激對(duì)防止血管內(nèi)皮損傷，預(yù)防和治療血管并發(fā)癥具有十分重要意義。

目前對(duì)糖尿病的臨床治療主要以控制血糖為主，二甲雙胍是治療2型糖尿病最常用的雙胍類藥物，具有降低血糖，改善胰島素抵抗，降低氧化應(yīng)激等作用[2]。除了臨床干預(yù)外，生活方式改變尤其是運(yùn)動(dòng)已被認(rèn)為是預(yù)防和治療2型糖尿病的推薦方法。規(guī)律性有氧運(yùn)動(dòng)可以調(diào)節(jié)血糖代謝，提高機(jī)體抗氧化能力，降低慢性炎癥，對(duì)心血管具有保護(hù)作用[3]，但其作用效果還并不十分明確。本研究擬通過(guò)對(duì)2型糖尿病大鼠進(jìn)行8周二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，評(píng)價(jià)二甲雙胍、有氧運(yùn)動(dòng)及兩者聯(lián)合干預(yù)對(duì)2型糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，6周齡共46只，體重220～270 g，由吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(閩)2012-0001]，飼養(yǎng)在福建師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(閩)2015-0004]。環(huán)境溫度：22oC ～24℃，濕度：50%～70%，光照：12 h∶12 h。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食。隨機(jī)抽取6只作為正常對(duì)照組，并給予正常飼料喂養(yǎng)，其余大鼠用于制作2型糖尿病模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

二甲雙胍(上海生工生物工程公司)；胰島素(insulin)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)Elisa試劑盒(南京建成生物工程研究所)；NADPH 氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4, NOX4)4抗體、GADPH抗體、核因子相關(guān)因子2(nuclear factor-e2-related factor 2, Nrf2)抗體、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)抗體(Abcam 英國(guó))；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒、總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 德國(guó))；血糖儀(羅氏 美國(guó))；凝膠電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽(Bio-Rad 美國(guó))；凝膠電泳成像分析儀(ProteinSimple美國(guó))；酶標(biāo)儀(Tecan美國(guó))；分光光度計(jì)(Bio-Rad美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 2型糖尿病模型構(gòu)建

采用高脂飲食，小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病模型。40只大鼠高脂飼料(15%蔗糖，15%豬油，5蛋黃粉，0.2%膽酸鈉，64.8%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)四周后，禁食12 h，腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液；劑量30 mg/kg)[4-5]，正常對(duì)照組注射相應(yīng)容量的檸檬酸緩沖液。STZ注射2周后，空腹血糖值持續(xù)大于11.1 mmol/L，確定為2型糖尿病模型，最終符合糖尿病模型大鼠共32只。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組

將大鼠分為5組：正常對(duì)照組(NC, n=6)；糖尿病對(duì)照組(DC, n=7)；糖尿病運(yùn)動(dòng)組(DS, n=9)，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)；糖尿病二甲雙胍干預(yù)組(DM, n=7)，進(jìn)行二甲雙胍處理；糖尿病二甲雙胍+運(yùn)動(dòng)聯(lián)合干預(yù)組(DMS, n=9)，同時(shí)給予二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)處理。干預(yù)時(shí)間共8周。

1.3.3 給藥方法

二甲雙胍溶入飲水中給予大鼠攝取，藥物劑量參考已有的研究[6]，第1周劑量為150 mg/(kg·d)，第2周為300 mg/(kg·d)，第3周調(diào)整為450 mg/(kg·d)，該劑量一直保持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。監(jiān)控大鼠體重和飲水量變化，每周根據(jù)體重變化調(diào)整一次藥物劑量。

1.3.4 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)組大鼠采用游泳運(yùn)動(dòng)方式，每天1 h，每周5 d，共8周。1～4周大鼠無(wú)負(fù)重進(jìn)行游泳，5～8周負(fù)重1%體重(重物系尾部)。游泳池為圓形塑料桶(直徑60 cm×高75 cm)，水深不低于45 cm，水溫控制在32℃～34℃，每桶同時(shí)容納3只大鼠。時(shí)刻監(jiān)控大鼠游泳狀況，以防大鼠溺水。

1.3.5 樣本制備

最后一次運(yùn)動(dòng)結(jié)束后24 h處死。血液樣本以4℃， 3500 r/min離心10 min，取上清液，-20℃保存。迅速剝離主動(dòng)脈，取小部分放入4%多聚甲醛中固定，其余放置-80℃冰箱中保存待用。

1.3.6 生化指標(biāo)檢測(cè)

大鼠禁食12 h后尾部取血，使用血糖儀和試紙檢測(cè)大鼠血糖濃度。采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清insulin、TNF-α和VCAM-1濃度。

1.3.7 病理標(biāo)本制備

從固定液中取出主動(dòng)脈組織，進(jìn)行脫水、透明和石蠟包埋。組織切片4 μm，脫蠟復(fù)水、HE染色、脫水、透明、樹(shù)膠封片，最后顯微鏡拍照。

1.3.8 大鼠血管組織SOD和MDA檢測(cè)

將主動(dòng)脈按1∶9比例加入生理鹽水研磨制作組織勻漿液；然后采用BCA法測(cè)量勻漿液的蛋白濃度，最后按照試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并根據(jù)公式計(jì)算出組織勻漿液SOD活性和MDA濃度。

1.3.9 Western blotting

先提取主動(dòng)脈總蛋白并檢測(cè)蛋白濃度。95℃加熱變性后放入-80℃ 保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浞蛛x膠和濃縮膠，上樣，打開(kāi)電源，直到溴酚藍(lán)到達(dá)電泳槽底部。電泳完成后轉(zhuǎn)膜1.5 h。轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉1 h， 4℃ 孵育過(guò)夜，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光顯色、拍照，并進(jìn)行蛋白條帶灰度檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠血糖代謝相關(guān)指標(biāo)

圖1顯示了8周干預(yù)后大鼠血糖代謝指標(biāo)變化。從圖中看出，糖尿病大鼠空腹血糖(FBG)均顯著高于正常組(P<0.01)，其中DC組空腹血糖值最高，DM和DMS組大鼠空腹血糖顯著低于DC組(P<0.01)。DC組空腹胰島素(FINS)顯著高于NC組(P<0.01)，DS、DM和DMS組與DC組相比，空腹胰島素有了明顯的降低(P<0.01)。

2.2 大鼠主動(dòng)脈血管形態(tài)

鏡下觀察顯示8周干預(yù)后大鼠主動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)形態(tài)(圖2)。NC組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁光滑，內(nèi)皮細(xì)胞完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊。DC組與NC組相比，血管內(nèi)壁粗糙，內(nèi)皮細(xì)胞破損相對(duì)嚴(yán)重，平滑肌細(xì)胞排列凌亂。DS、DM和DMS組血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定程度的損傷，但與DC組相比，血管病變有所緩解，其中DMS組大鼠主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)保持相對(duì)完整。

注：與NC組比較，aP<0.05, AP<0.01；與DC組比較，b P<0.05, BP<0.01。圖1 大鼠空腹血糖和空腹胰島素Note. Compared with the NC group, aP<0.05, AP<0.01；compared with the DC group,b P<0.05, BP<0.01.Figure 1 Fasting blood glucose and fasting insulin levels in the rats

圖2 大鼠主動(dòng)脈的病理改變(HE染色,×200)Figure 2 Histological changes of the rat aortas(HE staining)

2.3 大鼠血管Nrf2、HO-1、SOD指標(biāo)

圖3顯示了8周二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后大鼠血管抗氧化水平。從圖A中可以看出，NC和DC組Nrf2蛋白表達(dá)較低，而DS、DM、DMS組表達(dá)顯著性升高(P<0.01)，給予二甲雙胍處理的兩個(gè)組Nrf2表達(dá)水平均高于DS組，其中DMS組與DS組相比，具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。從圖B中看出，DC組血管HO-1蛋白表達(dá)顯著低于NC組(P<0.01)。三組干預(yù)組表達(dá)水平均顯著高于DC組(P<0.01)，DM和DMS組HO-1蛋白表達(dá)水平不僅高于DC組，而且還明顯高于NC和DS組(P<0.01，P<0.05)。圖C顯示了大鼠血管SOD水平。DC組SOD水平最低，三個(gè)干預(yù)組SOD水平均高于DC組，其中DS和DMS組SOD水平與DC組相比具有統(tǒng)計(jì)性意義(P<0.05)。

注：A:Nrf2蛋白表達(dá)；B:HO-1蛋白表達(dá)；C:SOD活性。與NC組比較，aP<0.05, AP<0.01；與DC組比較，bP<0.05, BP<0.01；與DS組比較，c P<0.05, C P<0.01。圖3 大鼠主動(dòng)脈組織中的Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)和SOD活性Note. A, Protein expression of Nrf2; B, Protein expression of HO-1; C, Activity of SOD. Compared with the NC group, aP<0.05, AP<0.01. Compared with the DC group, bP<0.05, BP<0.01. Compared with the DS group,cP<0.05, CP<0.01.Figure 3 The expression of Nrf2 and HO-1 proteins and activity of SOD in the rat aorta tissues

2.4 大鼠血管NOX4和MDA指標(biāo)

圖4反映了糖尿病大鼠血管氧化水平。從圖A中可以看出，糖尿病組血管NOX4蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01,P<0.05)，其中，DC組表達(dá)量最高。三組干預(yù)組NOX4表達(dá)水平均顯著低于DC組(P<0.01)，其中DM組最低，與DS組相比，有統(tǒng)計(jì)性差異(P<0.05)。從圖B可以看出，DC組血管組織MDA水平明顯高于NC照組(P<0.05)。8周干預(yù)后，DM組和DMS組血管MDA水平均顯著低于DC組(P<0.05)。DS組MDA水平低于DC組，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 大鼠血清TNF-α和VCAM-1指標(biāo)

注：A:NOX4蛋白表達(dá)，B:MDA濃度. 與NC組比較，aP<0.05, AP<0.01；與DC組比較，bP<0.05, BP<0.01；與DS組比較，c P<0.05,C P<0.01。圖4 大鼠主動(dòng)脈組織中的NOX4蛋白表達(dá)和MDA濃度Note. A, Protein expression of NOX4. B, Concentration of MDA. Compared with the NC group, aP<0.05, AP<0.01. Compared with the DC group, bP<0.05, BP<0.01. Compared with the DS group,cP<0.05,C P<0.01.Figure 4 Expression of NOX4 protein and concentration of MDA in the rat aorta tissues

注：與NC組比較，aP<0.05, AP<0.01；與DC組比較，bP<0.05, BP<0.01；與DS組比較，c P<0.05,C P<0.01;與DM組比較，d P<0.05,D P<0.01。圖5 大鼠血清TNF-α和VCAM-1濃度Note. Compared with the NC group, aP<0.05, AP<0.01. Compared with the DC group, bP<0.05, BP<0.01. Compared with the DS group,cP<0.05, CP<0.01.Figure 5 Serum concentrations of TNF-α and VCAM-1 in the rats

圖5顯示了大鼠血清炎癥標(biāo)志物度濃度水平。從圖中可以看出所有糖尿病組TNF-α濃度均高于正常對(duì)照組，其中，DC組濃度最高。三個(gè)干預(yù)組TNF-α濃度都有下降的趨勢(shì)，其中，DS組明顯低于DC組(P<0.05)，DMS組TNF-α濃度最低，并顯著低于其他三個(gè)糖尿病組(P<0.05，P<0.01)。為了進(jìn)一步了解主動(dòng)脈血管炎癥狀態(tài)，對(duì)大鼠血清VCAM-1濃度進(jìn)行了檢測(cè)，糖尿病大鼠血清VCAM-1濃度明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，其中DC組最高。DS、DM和DMS組VCAM-1水平都明顯低于DC組(P<0.01，P<0.05)，其中DS和DMS組水平明顯低于DM組(P<0.05)。

3 討論

大量的研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可以改善糖尿病患者胰島素抵抗，降低血糖[7-10]，美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)已將運(yùn)動(dòng)作為治療糖尿病的推薦方法[11]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)均可以降低糖尿病大鼠空腹血糖，但聯(lián)合干預(yù)的控糖效果更為顯著。二甲雙胍主要是通過(guò)抑制肝臟糖異生作用，增加外周組織對(duì)胰島素敏感性來(lái)控制血糖。有氧運(yùn)動(dòng)可以增加骨骼肌含量，促進(jìn)骨骼肌對(duì)對(duì)血糖的吸收，除此之外，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中肌源性IL-6濃度增加能夠刺激GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)外周組織對(duì)葡萄糖的吸收[12]。二甲雙胍與有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合干預(yù)在降低胰島素水平，提高胰島素敏感性上的效果要優(yōu)于單純二甲雙胍或有氧運(yùn)動(dòng)的治療效果，說(shuō)明二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)可能分別通過(guò)不同的信號(hào)途徑來(lái)提高胰島素敏感性，從而使得聯(lián)合干預(yù)在改善胰島素敏感性具有疊加效應(yīng)。

在脈管系統(tǒng)中，氧化應(yīng)激與許多血管損傷的病理過(guò)程有關(guān)，過(guò)多的ROS能夠?qū)е卵馨l(fā)生紊亂。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)均能有效緩解糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷，這可能與降低血糖和血管氧化應(yīng)激有關(guān)。NOX4是心血管系統(tǒng)中ROS最主要的來(lái)源之一，其主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[13]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，多種細(xì)胞應(yīng)激包括血流切應(yīng)力，糖基化蛋白，TNF-α等都可以上調(diào)NOX4表達(dá)，NOX4增加反過(guò)來(lái)?yè)p傷內(nèi)皮細(xì)胞[14]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，糖尿病對(duì)照組大鼠血管NOX4蛋白表達(dá)比正常組高達(dá)接近3倍的水平，MDA濃度也顯著高于正常組。8周二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)下調(diào)血管NOX4蛋白表達(dá)水平，同時(shí)MDA水平也同步下降，說(shuō)明二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)降低血管NOX4表達(dá)以及MDA水平來(lái)緩解血管氧化應(yīng)激。二甲雙胍同樣具有抗氧化功能，Sato等[15]研究顯示二甲雙胍可以通過(guò)抑制NOX4來(lái)緩解肺纖維化的發(fā)展。但本實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，給予二甲雙胍處理組大鼠NOX4表達(dá)明顯低于運(yùn)動(dòng)組，而運(yùn)動(dòng)和聯(lián)合干預(yù)也并沒(méi)有比二甲雙胍干預(yù)產(chǎn)生更好的效果，運(yùn)動(dòng)可能反而阻礙了二甲雙胍的抗氧化效用。這是否與運(yùn)動(dòng)激活機(jī)體的氧化系統(tǒng)有關(guān)，這還需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

Nrf2是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的重要調(diào)節(jié)器，與內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，促進(jìn)下游NQO1、HO-1、SOD等抗氧化酶基因的表達(dá)[16]。除此之外，Nrf2還能通過(guò)其下游HO-1發(fā)揮對(duì)血管的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)不僅上調(diào)糖尿病大鼠血管Nrf2蛋白水平，同時(shí)還增加了下游因子HO-1蛋白表達(dá)和SOD活性，說(shuō)明二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)可能激活糖尿病大鼠血管Nrf2/ARE信號(hào)通路。目前研究已經(jīng)證明運(yùn)動(dòng)能夠提高機(jī)體抗氧化能力，且許多研究認(rèn)為運(yùn)動(dòng)的抗氧化效應(yīng)可能是通過(guò)Nrf2實(shí)現(xiàn)的[17]，本研究結(jié)果與之前研究較為相似。近年來(lái)許多報(bào)道顯示了二甲雙胍的抗氧化特性[18]。Zhou等[19]研究發(fā)現(xiàn)給予4周二甲雙胍處理能明顯上調(diào)胰島素抵抗小鼠肝臟和骨骼肌Nrf2及NQO1和HO-1蛋白表達(dá)。因此，可以推測(cè)，二甲雙胍與有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)激活Nrf2信號(hào)及下游抗氧化酶基因表達(dá)來(lái)增加糖尿病大鼠血管抗氧化能力。

氧化應(yīng)激在許多疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。糖尿病狀態(tài)下長(zhǎng)期高血糖誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的ROS，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)激活相關(guān)炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)VCAM-1和TNF-α等炎癥基因的表達(dá)，促使血管發(fā)生病變[20-21]。研究數(shù)據(jù)顯示，二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)均能有效降低糖尿病大鼠血清TNF-α和VCAM-1濃度。VCAM-1主要表達(dá)于血管組織，是血管炎癥的主要標(biāo)志[22]，說(shuō)明二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)能夠緩解糖尿病大鼠血管炎癥。近年來(lái)有證據(jù)表明，二甲雙胍除了具有調(diào)節(jié)血糖平衡外，還能夠降低炎癥[23-24]。長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)肌源性IL-6的分泌，改善循環(huán)血液的抗炎環(huán)境[25]。二甲雙胍與有氧運(yùn)動(dòng)的抗炎作用主要是通過(guò)降低氧化應(yīng)激途徑實(shí)現(xiàn)，這與上述的研究結(jié)果一致。

綜上所述，二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖代謝平衡，緩解糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。二甲雙胍和有氧運(yùn)動(dòng)可能是通過(guò)激活Nrf2信號(hào)，增加下游抗氧化酶表達(dá)，抑制NOX4表達(dá)，降低ROS生成來(lái)降低糖尿病大鼠血管氧化應(yīng)激。