兒茶素沒食子酸酯對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制研究

劉艷 ，張懿 ，雷銳 ，周海艷

年齡相關(guān)性黃斑變性 （Age-related macular degeneration，AMD）為老年人群視力減弱的主要病因之一。早期研究已證實(shí)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelium，RPE）的氧化應(yīng)激損傷與AMD的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[1-3]。當(dāng)前在AMD治療研究大多集中在抗氧化劑的藥理活性上面，主要是對(duì)各種中成藥的探討，但對(duì)它們的作用效果及作用機(jī)制報(bào)道較少，于是尋找一種預(yù)防和治療AMD的有效藥物勢在必行。兒茶素沒食子酸（Epigallocatechin gallate，EGCG）是一種天然黃烷醇型活性化合物，具有抗氧化應(yīng)激及抗炎性反應(yīng)的藥理活性[4-6]，而且研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有較好的藥理活性[7]。腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6（TRAF6）屬于胞內(nèi)銜接蛋白，可以傳導(dǎo)胞膜受體介導(dǎo)的胞外刺激信號(hào)，誘導(dǎo)下游TAK1介導(dǎo)的信號(hào)通路激活，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生[8-9]。因此，本課題主要研究EGCG對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮 （ARPE-19）細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，并探討其對(duì)介導(dǎo)氧化應(yīng)激TRAF6/TAK1信號(hào)通路活化的影響，以期對(duì)AMD的治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

人視網(wǎng)膜色素上皮 （ARPE-19）細(xì)胞來源ARPE-19細(xì)胞購自武漢巴菲爾生物有限公司（來源于美國ATCC細(xì)胞庫）。兒茶素沒食子酸酯（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：1257-08-5，純度≥98%）；DMEM 培養(yǎng)基（美國 ScienCell公司）；胎牛血清 （美國Gibco公司）；胰蛋白酶購自美國Thermo scientific 公司（批號(hào)：R001100）；MDA、NO、SOD1 試劑盒購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司 （批號(hào)：TS-49350、TB-58260、BR-46250）；CCK8 試劑盒購自上海恒遠(yuǎn)公司（批號(hào)：ST-20059）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司 （批號(hào)：P0012AC）；兔抗大鼠 β-actin（貨號(hào) ab108267）、HO-1（貨號(hào) ab256745）、SOD1 （貨號(hào) ab203214）、TRAF6（貨號(hào) ab552260）、TAK1（貨號(hào) ab205628）及 p-TAK1（貨號(hào)ab587415）一抗均購自英國Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 儀器

儀器BIORAD-550型酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）；BBS-V800型單人超凈臺(tái) （山東鑫貝西公司）；SPX-250型細(xì)胞培養(yǎng)箱 （美國Thermo公司）；GE-100型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）；7230G數(shù)顯可見紫外分光光度計(jì)測定儀（上海菁華）。

1.3 ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)

采用常規(guī)DMEM完全培養(yǎng)基 （10%的胎牛血清、1%的100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2濃度，待細(xì)胞長滿至90%左右時(shí)用PBS清洗后加入胰酶消化，顯微鏡下觀察待細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，分裝于3個(gè)培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 分組及藥物處理

將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、H2O2（100 μmol/L）誘導(dǎo)組、H2O2+低劑量（40 μmol/L）EGCG 組、H2O2+中劑量（80 μmol/L）EGCG 組、H2O2+高劑量（160 μmol/L）EGCG組，采用H2O2刺激細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型，同時(shí)加入EGCG干預(yù)細(xì)胞進(jìn)行藥物治療，二者同時(shí)作用長達(dá)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 CCK8法 將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行消化重懸接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后吸去舊培養(yǎng)基，按“1.4”項(xiàng)分組及藥物處理24 h后吸去舊培養(yǎng)基，然后每孔加入10 μL CCK8試劑，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中孵育1 h后，置于酶標(biāo)儀中測定每孔細(xì)胞的吸光度OD值，檢測波長設(shè)置為450 nm，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞生存率（%）=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.5.2 MDA、NO含量及SOD活性檢測 取對(duì)數(shù)生長期的ARPE-19細(xì)胞，清洗、消化、重懸細(xì)胞后，取適量濃度細(xì)胞接種至6孔板中，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。低、中、高劑量EGCG和H2O2共孵育細(xì)胞，加入含藥物的終體積為2 mL/孔。藥物作用24 h后，收集細(xì)胞裂解成勻漿液，按照試劑說明書測定MDA、NO含量及SOD活性。

1.5.3 Western Blot將“1.5.2”項(xiàng)收集的細(xì)胞裂解制備成勻漿，離心收集上清提取細(xì)胞蛋白。BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度。各孔取50 μg的蛋白上樣，于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離 （濃縮膠70 mV電壓，40 min；分離膠120 mV電壓，90 min）。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移 （275 mA電流，90 min）至PVDF膜。加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1h。用TBST洗膜3次，每次8 min，分別加入HO-1、SOD1、TRAF6、TAK1 及 p-TAK1 抗體（體積稀釋比例均為1:1000）4℃反應(yīng)過夜。次日先以TBST洗膜3次，每次10 min。后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1:3000），室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min。按ECL試劑盒說明進(jìn)行顯影。采用雙色紅外激光成像系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，若P＜0.05，則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖的影響

與正常對(duì)照組比較，H2O2誘導(dǎo)組中細(xì)胞增殖受到明顯抑制（P＜0.05）；與 H2O2誘導(dǎo)組比較，各劑量 EGCG組細(xì)胞相對(duì)存活率明顯升高，差異均有顯著性（P＜0.05），并且隨著EGCG劑量的增加，細(xì)胞相對(duì)存活率也隨著增高，呈現(xiàn)出濃度依賴性（F=10.326，P＜0.05）（圖 1）。

圖1 不同組間ARPE-19細(xì)胞增殖情況比較。1正常對(duì)照組；2 H2O2誘導(dǎo)組；3 H2O2+低劑量EGCG組；4 H2O2+中劑量EGCG組；5 H2O2+高劑量EGCG組。*與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；#與H2O2誘導(dǎo)組比較，P＜0.05。

2.2 EGCG對(duì)ARPE-19細(xì)胞勻漿氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平的影響

與正常對(duì)照組比較，H2O2誘導(dǎo)組中細(xì)胞勻漿MDA及NO水平明顯升高，SOD1活性顯著降低（P＜0.05）；與H2O2誘導(dǎo)組比較，各劑量EGCG組細(xì)胞勻漿MDA及NO水平明顯降低，而SOD1活性明顯升高，差異均有顯著性（P＜0.05），并且隨著EGCG劑量的增加，細(xì)胞勻漿MDA及NO水平隨著降低、SOD1活性隨之升高，表現(xiàn)出濃度依賴性 （F值分別為6.357、14.361、10.326，P 值均＜0.05）（表 1）。

表1 EGCG對(duì)ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平的影響（xˉ±s）

2.3 EGCG對(duì)ARPE-19細(xì)胞中HO-1及SOD1表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，H2O2誘導(dǎo)組中HO-1及SOD1表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與 H2O2誘導(dǎo)組比較，各劑量EGCG組細(xì)胞HO-1及SOD1表達(dá)水平明顯升高，差異均有顯著性（P＜0.05），并且隨著EGCG劑量的增加，細(xì)胞HO-1及SOD1表達(dá)水平而隨著升高，表現(xiàn)出濃度依賴性 （F值分別為11.035、8.361，P 值均＜0.05）（圖 2）。

圖2 不同組間HO-1及SOD1蛋白表達(dá)比較。1正常對(duì)照組；2 H2O2誘導(dǎo)組；3 H2O2+低劑量EGCG組；4 H2O2+中劑量EGCG組；5 H2O2+高劑量EGCG組。2A HO-1蛋白表達(dá)；2B SOD1蛋白表達(dá)。*與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；# 與 H2O2誘導(dǎo)組比較，P＜0.05。

2.4 EGCG對(duì)ARPE-19細(xì)胞中TRAF6/TAK1信號(hào)通路的影響

與正常對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組中TRAF6表達(dá)及TAK1磷酸化水平明顯升高（P＜0.05）；與 H2O2誘導(dǎo)組比較，各劑量EGCG組細(xì)胞TRAF6表達(dá)及TAK1磷酸化水平明顯降低，差異均有顯著性（P＜0.05），并且隨著EGCG劑量的增加，細(xì)胞TRAF6表達(dá)及TAK1磷酸化水平而隨著降低，表現(xiàn)出濃度依賴性（F值分別為 5.395、7.039，10.326，P 值均＜0.05）（圖 3）。

圖3 不同組間TRAF6及p-TAK1蛋白表達(dá)比較。1正常對(duì)照組；2 H2O2誘導(dǎo)組；3 H2O2+低劑量EGCG組；4 H2O2+中劑量 EGCG組；5 H2O2+高劑量EGCG組。3A TRAF6蛋白表達(dá)；3B p-TAK1蛋白表達(dá)。* 與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；# 與H2O2誘導(dǎo)組比較，P＜0.05。

3 討論

AMD的病原學(xué)及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，當(dāng)前研究證實(shí)細(xì)胞老化、氧化應(yīng)激損傷、炎性免疫、血管生成和抑制因子上調(diào)等因素均會(huì)誘發(fā)AMD的發(fā)生[10]。伴隨著年齡的增長，機(jī)體抗氧化能力也隨之減弱，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞介于脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層及光感受器細(xì)胞層之間，容易引起機(jī)體氧自由基的攻擊，進(jìn)一步引發(fā)AMD等視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)AMD發(fā)病早期便會(huì)出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，并常伴隨該細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)[11]。

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的細(xì)胞器為線粒體，而損傷的嚴(yán)重程度由活性氧的水平?jīng)Q定，后者可介導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)一步參與視網(wǎng)膜色素細(xì)胞屏障功能的損傷。體外研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷能夠?qū)е乱暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，這可能為AMD早期該細(xì)胞發(fā)生凋亡的其中一個(gè)原因[12]。H2O2屬于一種極易透過細(xì)胞膜的強(qiáng)氧化劑，通過增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷的作用[13]。

EGCG作為綠茶的主要活性成分之一有著顯著的抗腫瘤功效，能通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞分裂周期、調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路活性、降低癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等來起到抑制腫瘤的作用[14]；除此之外，EGCG已被證實(shí)在抗氧化應(yīng)激等方面也起著較好的藥理作用[15]。然而EGCG對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的保護(hù)作用研究未見報(bào)道，于是本研究采用活性氧形式之一的H2O2作用ARPE-19細(xì)胞，引起該細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，探討EGCG對(duì)ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，本文采用H2O2體外誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)組細(xì)胞相對(duì)存活率明顯降低，細(xì)胞勻漿中氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、NO水平升高、而SOD1酶活性降低，細(xì)胞中HO-1、SOD1蛋白表達(dá)顯著降低，說明實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的ARPE-19氧化損傷細(xì)胞模型成功。接著采用低、中、高劑量EGCG干預(yù)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，EGCG可明顯抑制ARPE-19細(xì)胞勻漿中氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、NO水平，而能誘導(dǎo)SOD1酶活性及水平的上升，進(jìn)而誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞增殖能力的升高。提示EGCG對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。

胞內(nèi)銜接蛋白TRAF6活化后可在TAB-1及TAB-2介導(dǎo)下，與MAP3K家族成員TAK1結(jié)合并將其激活，后者可進(jìn)一步激活氧化應(yīng)激信號(hào)通路[16]。研究已提出TRAF6/TAK1信號(hào)通路可參與氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而抑制了抗氧化酶HO-1、SOD1表達(dá)，誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、NO的產(chǎn)生[17]。研究還發(fā)現(xiàn)EGCG可通過抑制TRAF6信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而降低黑色素瘤細(xì)胞的增殖[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用低、中、高劑量EGCG干預(yù)ARPE-19細(xì)胞后，TRAF6表達(dá)及p-TAK1水平明顯降低，說明EGCG能抑制氧化損傷的ARPE-19細(xì)胞中TRAF6/TAK1信號(hào)通路的活化，從而降低氧化應(yīng)激損傷。綜上所述，研究結(jié)果表明H2O2可以成功的誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞氧化損傷模型，EGCG干預(yù)后能明顯降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物的產(chǎn)生，提示EGCG對(duì)AMD具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能與抑制TRAF6/TAK1信號(hào)通路活化有關(guān)。