養(yǎng)血補腎方對實驗性近視眼視網(wǎng)膜p-Stat3活性蛋白的表達影響

邢凱 ，亢澤峰 ，吳寧玲 ，劉健 ，劉彥江

養(yǎng)血補腎方是莊曾淵研究員治療高度近視的經(jīng)驗方，前期動物實驗結(jié)果顯示該方可以降低豚鼠形覺剝奪性近視（form-deprivation myopia,FDM）模型眼的鞏膜細胞凋亡率，抑制鞏膜的重塑變薄和異常拉伸[1]，但對其上游機制尚不清楚，比如對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）途徑是否存在影響。SATA3是Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 （Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT）家族成員，晶狀體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜組織中均有這一家族成員的分布[2-4]，JAK/STAT通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有研究提示STAT3信號通路與FDM的發(fā)生有關(guān)[5]。本實驗在建立豚鼠FDM模型的基礎(chǔ)上應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白在實驗性近視眼中的動態(tài)表達，為進一步探討?zhàn)B血補腎方對這一通路在近視形成與發(fā)展中所起的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：取2周年齡大小的普通級三色健康豚鼠，40只，雄性，由北京科宇動物養(yǎng)殖中心提供，體質(zhì)量180～200 g，動物許可證號為SCXK （京）2012-0004。動物房溫度控制在20～22℃之間，正常飼養(yǎng)，添加5 mg/L維生素C。

養(yǎng)血補腎方：車前子15 g，枸杞子15 g、熟地黃15 g、覆盆子 15 g、五味子 15 g、丹參 12 g、當歸 12 g、菟絲子 15g、白芍 12g、川芎 12g、黃芪 20g、白術(shù) 12g，采購于北京燕北飲片廠。

主要實驗儀器：YZ24帶狀光檢影鏡 （南昌高騰科技有限公司），眼科A/B型超聲診斷儀（徐州市凱信電子設(shè)備有限公司），B×51顯微鏡，ASP 300S自動脫水機 （德國徠卡公司），LEICA 255鋪片機，BM 450A型多功能包埋機，德國徠卡公司EMTP全自動組織處理機，JEM-1400電鏡 （日本電子），RM2255切片機（德國Leica公司），EG1150C冰臺（德國Leica公司），HI1220 烤片機（德國 Leica公司），EI1210攤片機（德國Leica公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 豚鼠實驗性近視制備與分組 制備豚鼠FDM模型[6]：取40只2周齡普通級三色健康豚鼠，雄性，標記。飼養(yǎng)1周后予檢影、驗光、測量眼軸長度（方法見下），以右眼作為FDM模型眼（遮蓋眼），半透明塑料（即白色氣球制作）眼罩遮蓋，左眼作為對照眼（未遮蓋眼）不做處理。

正常喂養(yǎng)60 d后，再次進行檢影、驗光檢查并測量眼軸，確定成功建立FDM模型[6]。將豚鼠隨機分成2組，各組均為20只，對照組不行任何處理，治療組以養(yǎng)血補腎方12.7 g/kg灌胃（按照生藥量），給藥21 d后進行取材檢測。

1.2.2 檢測眼屈光度數(shù) 在暗室條件下應(yīng)用1%復(fù)方托吡卡胺滴眼液（美多麗）給豚鼠散瞳，檢影驗光。FDM模型建立前后均要檢查雙眼1次。

1.2.3 測量眼軸長度 在室內(nèi)自然光條件，豚鼠結(jié)膜囊滴0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液（倍諾喜）表麻，應(yīng)用眼科A/B超測豚鼠雙眼的眼軸長度，測量3次，最后取平均值，記錄。FDM模型建立前后均要檢查雙眼1次。

1.2.4 視網(wǎng)膜組織顯微鏡觀察 在實驗結(jié)束以后，采用 1 g/L 氯胺酮來麻醉豚鼠（75～100 mg/kg）,然后剪開眼球結(jié)膜,并立即摘除豚鼠的雙側(cè)眼球,再在顯微鏡下沿眼球角鞏膜緣逐步剪開,剝離豚鼠眼球的鞏膜和視網(wǎng)膜,并將鞏膜和視網(wǎng)膜組織置于4%多聚甲醛固定液中，固定。在24 h以后取出視網(wǎng)膜組織，脫水透明浸臘以后，包埋切片，脫水，染色，封片。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色法檢測 取實驗中豚鼠對照組及其治療組豚鼠各8只，處死摘除眼球，常規(guī)石蠟包埋，取視網(wǎng)膜組織以備同時采用了Western blot法提取蛋白，所有組織蠟塊于近后極部連續(xù)切片7張，每張切片厚5 μm，用于免疫組化染色。免疫組織化學(xué)染色切片采用“北航圖像分析系統(tǒng)”測量陽性區(qū)灰度值，作為p-STAT3在組織中的半定量表達，隨機分別選取后部視網(wǎng)膜各10個部位進行圖像掃描，用平均灰度值表示p-STAT3的相對蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，豚鼠雙眼屈光度、眼軸長度比較以及同一眼造模前后的屈光度、眼軸長度比較均采用配對資料t檢驗，同期組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；對免疫組織化學(xué)法檢測p-Stat3，采用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(xˉ±s)表示，若 P＜0.05，則認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 屈光度改變

造模前幼年豚鼠擬造模眼與對照眼的屈光度分別為（3.924±3.392）D，（3.860±1.597）D，均呈遠視狀態(tài)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.089）。模型眼遮蓋60 d后，屈光度變化為（-2.583±2.954）D，同期對照眼的屈光度為（3.488±1.281）D。模型眼形成了（-6.507±1.738）D的相對近視，與同期對照眼及造模前自身比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（與同期對照眼比較P=0.001；與造模前自身比較，t=14.116，P=0.001），對照眼屈光度前后變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 （表 1）

2.2 眼軸長度對比

造模前幼年豚鼠擬造模眼與對照眼的眼軸分別為（7.557±0.176）mm，（7.612±0.218）mm，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.084）。完成造模后，豚鼠模型眼、對照眼的眼軸分別變?yōu)椋?.278±0.250）mm，（8.016±0.199）mm，較前均有增加（模型眼，t=-15.379，P＜0.01；對照眼，t=-7.505，P＜0.01），模型眼的眼軸大于同期對照眼，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 （表 1）

2.3 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變

HE染色顯示：對照組模型眼視網(wǎng)膜外叢狀層會有空泡狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，外核層細胞層數(shù)減少，可見部分細胞核溶解，內(nèi)核層細胞數(shù)目減少，有空泡狀結(jié)構(gòu)存在，也可見到細胞核溶解或者碎裂，外叢狀層變薄，有空泡及毛刷狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)細胞層間隙增大，可見細胞水腫。治療組模型眼視網(wǎng)膜可見少量外節(jié)狀層會有泡狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，部分細胞水腫（圖1）。

表1 豚鼠屈光度和眼軸變化（xˉ±s）

2.4 視網(wǎng)膜中p-STAT3的表達

p-STAT3陽性細胞的細胞核呈棕黃色，對照組對照眼的p-STAT3陽性細胞主要分布在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層，外核層偶見（圖2A)；對照組模型眼視網(wǎng)膜組織的p-STAT3有微弱表達（圖2B)，主要分布在視網(wǎng)膜色素上皮及視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)的細胞核內(nèi)；治療組模型眼陽性細胞位于神經(jīng)節(jié)細胞核，內(nèi)核層細胞核中，陽性信號為棕黃色顆粒樣（圖 2C）。

對照組對照眼、對照組模型眼、治療組模型眼視網(wǎng)膜p-STAT3蛋白表達的平均灰度值分別為0.310±0.055，0.370±0.069，0.365±0.046，三組數(shù)值總體上無統(tǒng)計學(xué)意義上的差異 （單因素方差分析，F(xiàn)=2.691，P=0.091）。兩兩比較，對照組模型眼及治療組模型眼的視網(wǎng)膜p-STAT3蛋白表達均高于對照組對照眼，對照組對照眼與對照組模型眼的差異最大（P=0.049），對照組對照眼與治療組模型眼（P=0.069），對照組模型眼與治療組模型眼 （P=0.863）的p-STAT3表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。提示養(yǎng)血補腎方對豚鼠FDM模型眼的視網(wǎng)膜p-STAT3蛋白表達變化無明顯影響。

圖1 2組豚鼠后極部視網(wǎng)膜組織的光鏡圖（HE染色，×40）。1A 對照組的對照眼（未遮蓋眼），視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)大致正常；1B治療組的FDM模型眼（遮蓋眼），視網(wǎng)膜可見少量外節(jié)狀層會有泡狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，部分細胞水腫；1C對照組的FDM模型眼（遮蓋眼），視網(wǎng)膜外叢狀層會有空泡狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，外核層細胞層數(shù)減少，可見部分細胞核溶解，內(nèi)核層細胞數(shù)目減少，有空泡狀結(jié)構(gòu)存在，也可見到細胞核溶解或者碎裂，外叢狀層變薄，有空泡及毛刷狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)細胞層間隙增大，可見細胞水腫。FDM：形覺剝奪性近視

3 討論

圖2 視網(wǎng)膜p-STAT3蛋白表達的免疫組化圖（×40）。2A對照組對照眼的p-STAT3陽性細胞主要分布在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層，外核層偶見；2B對照組FDM模型眼，視網(wǎng)膜組織的p-STAT3有微弱表達，主要分布在視網(wǎng)膜色素上皮及視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)的細胞核內(nèi)；2C治療組FDM模型眼，陽性細胞位于神經(jīng)節(jié)細胞核，內(nèi)核層細胞核中，陽性信號為棕黃色顆粒樣。p-STAT3：磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；FDM：形覺剝奪性近視

已有的研究證實，近視眼的發(fā)病與多種因素相關(guān)，其中最主要的是遺傳和環(huán)境因素。最近幾年研究發(fā)現(xiàn)，Jak-Stat通路可參與一些細胞的增殖、分化和抗凋亡等[7-8]。朱子誠等[5]研究表明STAT3信號通路可能參與了FDM形成與發(fā)展，STAT3作為信使，以視網(wǎng)膜光感受器為載體，導(dǎo)致近視的發(fā)展[9-10]。

養(yǎng)血補腎方是四物五子湯添加丹參，黃芪，白術(shù)共同組成。方中熟地黃、當歸、白芍、川芎等中藥主要滋陰養(yǎng)血，菟絲子、車前子、枸杞子、覆盆子等藥物補肝腎明目，黃芪和白術(shù)健脾益氣，諸藥合用共奏補益肝腎，滋陰補血，養(yǎng)心明目之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[11]四物五子湯中鋅含量高，可能是通過補充微量元素鋅，改善了眼部的微循環(huán)，從而使目系得養(yǎng)，目竅功能恢復(fù)正常，該方可以改善眼內(nèi)微循環(huán),增加眼肌營養(yǎng),解除睫狀肌痙攣,調(diào)節(jié)屈光度。臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)該方能改善實驗性近視患者的視功能，從一定程度上延緩實驗性近視的發(fā)展，侯靜梅等[1]研究已證實養(yǎng)血補腎方能夠明顯改善豚鼠形覺剝奪性近視眼鞏膜組織的形態(tài)，顯著降低鞏膜細胞的凋亡，其藥理機制可能是能夠減少鞏膜細胞凋亡，從而有效抑制鞏膜細胞的重塑變薄和異常拉伸,達到阻止眼軸的變長,控制實驗性近視發(fā)展的作用。提示養(yǎng)血補腎方可能通過降低鞏膜細胞凋亡來發(fā)揮對鞏膜細胞保護作用。而本實驗在建立豚鼠FDM模型的基礎(chǔ)上應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白在實驗性近視眼中的動態(tài)表達，結(jié)果提示：對照組模型眼及治療組模型眼的視網(wǎng)膜p-STAT3蛋白表達均高于對照組對照眼，對照組對照眼與對照組模型眼比較有統(tǒng)計學(xué)差異，對照組對照眼與治療組模型眼，對照組模型眼與治療組模型眼的p-STAT3表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，p-STAT3在未遮蓋豚鼠眼視網(wǎng)膜中有微弱表達，遮蓋后p-STAT3表達相比遮蓋前上調(diào)，但結(jié)果比較無統(tǒng)計學(xué)意義，提示養(yǎng)血補腎方對視網(wǎng)膜p-Stat3蛋白的表達變化無影響。

Peterson等[12]研究了一系列應(yīng)激反應(yīng)、條件性刺激對CNTF介導(dǎo)的Jak-stat信號通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露于亞毒性光、機械創(chuàng)傷及全身應(yīng)用腎上腺素能受體α2激動劑甲苯噻嗪后視網(wǎng)膜中的STAT3被激活。朱子誠等[5]研究發(fā)現(xiàn)p-STAT3在形覺剝奪近視發(fā)生發(fā)展中有重要作用。另外，在生理狀態(tài)下，生長因子誘導(dǎo)的Stat信號通路激活處在嚴格的調(diào)控之下，但是慢性的或持續(xù)的激活可能會擾亂生長因子—STAT3信號通路的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，最終導(dǎo)致靶組織的病理改變[13]。但研究發(fā)現(xiàn)[14]，幾乎所有此類物質(zhì)(稱為一級信使)的受體，均可在色素上皮或黑色素細胞上找到，通過STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，調(diào)節(jié)其下游的某些特定靶基因的表達，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管活性腸肽(VIP)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)等[15-16]作用于鞏膜，促進后部鞏膜的延長產(chǎn)生近視眼，此研究表明p-STAT3在未遮蓋豚鼠眼視網(wǎng)膜中有微弱表達，遮蓋后p-STAT3表達相比遮蓋前上調(diào)，說明STAT3信號通路可能參與了FDM形成與發(fā)展，p-STAT3作為信使，以豚鼠視網(wǎng)膜光感受器為載體，形成近視并進一步發(fā)展，但本研究表明養(yǎng)血補腎方對豚鼠視網(wǎng)膜p-STAT3蛋白的表達變化無影響，故養(yǎng)血補腎方受“肝主筋”、“肝受血而能視”理論啟發(fā)，是以養(yǎng)血補腎方滋補肝之氣血，從而使目之筋膜得到滋養(yǎng)，延緩高度近視鞏膜的重塑變薄，從而延緩高度近視的發(fā)展。