豚鼠圓窗EABR、EMLR與ELLR特征分析

梁文琦 宋新雨 劉攀 王偉 王林娥

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

電誘發(fā)聽性腦干反應(yīng)（electrically evoked auditory brainstem response，EABR）、電誘發(fā)中潛伏期反應(yīng)（electrically evoked middle latency response，EMLR）與電誘發(fā)長潛伏期反應(yīng)（electrically evoked late latency response,ELLR）均屬于電刺激聽覺誘發(fā)電位，它是人工耳蝸植入患者，尤其是兒童患者的一種重要客觀評估手段。它能反應(yīng)聽覺神經(jīng)傳導(dǎo)通路的完整性及功能，從而為人工耳蝸植入側(cè)別的選擇提供一種客觀依據(jù)，并可以用來預(yù)測人工耳蝸植入術(shù)后患者的聽覺言語康復(fù)效果。目前，患者電刺激聽覺誘發(fā)電位的引出率及其測試的穩(wěn)定性尚待進(jìn)一步摸索與探討，因此，研究和分析豚鼠全麻下各種圓窗電刺激聽覺誘發(fā)電位測試的刺激及相關(guān)記錄參數(shù)，可以有效保證電刺激聽覺誘發(fā)電位波形的引出率和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取健康豚鼠6只，雌雄不限，體重400-500g，耳廓反射靈敏，無強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，電耳鏡檢查鼓膜正常。

1.2 實驗環(huán)境及設(shè)備

1.2.1 實驗環(huán)境：EABR、EMLR、ELLR測試均在電磁屏蔽室進(jìn)行，屏蔽室墻壁銅網(wǎng)接地，操作者禁止攜帶電子設(shè)備，如手機(jī)等。

1.2.2 實驗設(shè)備：本實驗采用Neuro-Audio聽覺誘發(fā)電位儀(Neurosoft Ltd.,Ivanov,俄羅斯)，刺激設(shè)備選擇該公司外置電刺激器。實驗軟件使用Neuro-Audio1.0.103.2版本。誘發(fā)電位儀及電刺激器之間使用USB線纜連接于同一筆記本電腦。EABR、EMLR、ELLR的檢測均由刺激系統(tǒng)與記錄系統(tǒng)兩部分組成。其中刺激系統(tǒng)向耳蝸發(fā)放電刺激信號，記錄系統(tǒng)在頭部相應(yīng)位點記錄產(chǎn)生的誘發(fā)電位。

1.2.3 實驗電極：刺激電極為直徑約0.1mm銀球電極，電極一端呈圓球狀，圓球直徑約0.5mm，電極除球形端及尾端連接處裸露外，其余電極均由絕緣橡膠套包裹。記錄電極（正極）、參考電極（負(fù)極）及接地電極使用不銹鋼針狀電極。

1.3 實驗方法

采用10%水合氯醛（0.5 ml/100g）于豚鼠腹腔注射麻醉。麻醉滿意后先測試雙耳ABR，確認(rèn)聽力正常后，將豚鼠置于解剖臺，取側(cè)臥位，檢測耳朝上。去除豚鼠耳后毛發(fā)，牽拉耳廓向前，行耳后切口，逐層分離肌肉至骨面，1ml注射器針頭穿刺確認(rèn)聽泡位置。在顯微鏡下沿穿刺孔擴(kuò)大打開聽泡，暴露圓窗龕（見圖1）。將刺激電極正極（銀球電極）置于圓窗龕并貼附于圓窗膜表面，刺激電極負(fù)極置于同側(cè)乳突皮下，記錄電極置于兩外耳道口連線與顱正中線交叉處皮下，參考電極置于對側(cè)乳突皮下，地極置于鼻尖皮下（見圖2），保證單個電極阻抗＜5kΩ，極間阻抗小于3kΩ。實驗同時觀察豚鼠觸須及面部肌肉抽動情況。

圖1 示顯微鏡下打開聽泡，暴露圓窗龕。Fig.1 The otocyst were opened and the round window niche was exposed under the microscope.

圖2 示測試中各電極位置，包括刺激電極正極（a）、刺激電極負(fù)極（b）、記錄電極（c）、參考電極（d）、地極（e）。Fig.2 The position of each electrode in the test,includes the positive stimulating electrode(a),the negative stimulating electrode(b),the recording electrode(c),the reference electrode(d)and the ground electrode(e).

1.3.1 EABR測試

在Neuro-Audio1.0.103.2中選擇eABR（electrical stimulator）模式，刺激頻率 21Hz，分析時限10ms，疊加1024次，拒絕水平±10μV，信號輸入范圍 500μV，低 頻 100Hz，高 頻 1500Hz，采 樣 率160000Hz，交替極性單向脈沖電流，波寬100μs，采用同步觸發(fā)模式記錄結(jié)果。監(jiān)測時程40ms，監(jiān)測靈敏度20μV，采集時程2ms，采集靈敏度100μV，疊加時程1ms，疊加靈敏度5μV。

1.3.2 EMLR測試

在Neuro-Audio1.0.103.2中選擇MLR（基礎(chǔ)）模式，刺激頻率7Hz，分析時限100ms，疊加512次，拒絕水平±75μV，信號輸入范圍500μV，低頻30Hz，高頻300Hz，采樣率5000Hz，交替極性單向脈沖電流，波寬200μs，采用同步觸發(fā)模式記錄結(jié)果。監(jiān)測時程40ms，監(jiān)測靈敏度75μV，采集時程2ms，采集靈敏度1.5μV，疊加時程10ms，疊加靈敏度5μV。

1.3.3 ELLR測試

在Neuro-Audio1.0.103.2中選擇LLR（基礎(chǔ)）模式，刺激頻率1.8Hz，分析時限500ms，疊加1024次，拒絕水平±80μV，信號輸入范圍 500μV，低頻0.1Hz，高頻35Hz，采樣率5000Hz，交替極性單向脈沖電流，波寬200μs，采用同步觸發(fā)模式記錄結(jié)果。監(jiān)測時程40ms，監(jiān)測靈敏度100μV，采集時程100ms，采集靈敏度20μV，疊加時程50ms，疊加靈敏度5μV。

2 結(jié)果

潛伏期指從刺激開始到各波波峰出現(xiàn)的時間，閾值指能夠誘發(fā)產(chǎn)生明顯可識別波形的最小刺激強(qiáng)度，其中豚鼠EABR閾值以能夠誘發(fā)產(chǎn)生明顯可識別III波的最小刺激強(qiáng)度來判定，豚鼠EMLR閾值以能夠誘發(fā)產(chǎn)生明顯可識別Pa波的最小刺激強(qiáng)度來判定，豚鼠ELLR閾值以能夠誘發(fā)產(chǎn)生明顯可識別P2波的最小刺激強(qiáng)度來判定.

本實驗全麻下聽力正常豚鼠6只（12耳）在實驗過程中耐受良好，未出現(xiàn)觸須及面部肌肉抽動，未發(fā)生死亡。其中12耳均記錄到分化良好且穩(wěn)定的EABR波形，以III波最顯著（見圖3）；7耳記錄到分化良好且穩(wěn)定的EMLR波形（見圖4），7耳記錄到分化良好且穩(wěn)定的ELLR波形（見圖5）。豚鼠圓窗EABR（12耳）、EMLR（7耳）、ELLR（7耳）測試的閾值與潛伏期均值見表1-3。

圖3 示聽力正常豚鼠圓窗EABR波形?？梢鲚^明顯的Ⅲ波，隨著刺激量的增加波幅增大。Fig.3 EABR waves of healthy guinea pig.The obvious III wave can be induced,and the amplitude increases with the increase of stimulation.

圖4 示聽力正常豚鼠圓窗EMLR波形?？梢鲆?guī)律Na、Pa、Nb、Pb波，隨著刺激量的增加波幅增大。Fig.4 EMLR waves of healthy guinea pig.The regular Na,Pa,Nb and Pb waves can be induced,and the amplitude increases with the increase of stimulation.

圖5 示聽力正常豚鼠圓窗ELLR波形?？梢鲆?guī)律的P1、N1、P2波，隨著刺激量的增加波幅增大。Fig.5 ELLR waves of healthy guinea pig.The regular P1,N1 and P2 waves can be induced,and the amplitude increases with the increase of stimulation.

3 討論

聽力障礙嚴(yán)重影響人們的日常生活及社會活動，尤其是先天性聽力障礙的患兒，如果不能盡早恢復(fù)聽力，將導(dǎo)致其聽覺和言語發(fā)育發(fā)生難以逆轉(zhuǎn)的停滯。人工耳蝸植入（cochlear implant，CI）不僅可以幫助聽力障礙患者恢復(fù)聽力，更能夠促進(jìn)其言語的發(fā)育。人工耳蝸植入技術(shù)逐漸發(fā)展與成熟，但目前仍無可靠方法評價內(nèi)耳畸形、術(shù)前無殘余聽力、聽神經(jīng)病等患者的聽覺通路狀態(tài)與功能，因此無法預(yù)測這些患者CI術(shù)后聽覺言語康復(fù)效果。

近年來的多項研究認(rèn)為以電刺激為誘發(fā)形式的聽覺誘發(fā)電位，主要包括EABR、EMLR與ELLR等，能客觀反映聽覺通路的狀態(tài)和功能。1979年Starr和Brackmann首次報道了對多導(dǎo)人工耳蝸植入患者進(jìn)行EABR測試[1]。EABR通過刺激螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，誘發(fā)聽神經(jīng)和腦干產(chǎn)生相關(guān)電位活動，在潛伏期1-10ms范圍內(nèi)產(chǎn)生一系列反應(yīng)波形。EABR各波的起源和形態(tài)與聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem responses，ABR）各波基本相同：波Ⅰ來源于聽神經(jīng)，波Ⅱ主要來源于耳蝸核，波Ⅲ來源于上橄欖核，波Ⅳ來源于外側(cè)丘系核，波Ⅴ來源于下丘腦，波Ⅵ可能來源于內(nèi)側(cè)膝狀體，波Ⅶ可能來源于丘腦皮質(zhì)聽放射區(qū)域[2]。其中波Ⅰ、波Ⅱ和波Ⅳ不常出現(xiàn)在反應(yīng)波中，波Ⅲ和波Ⅴ較易被記錄到，而豚鼠最易分辨波形為III波，本研究中12耳均記錄到III波。EABR記錄了聽覺系統(tǒng)誘發(fā)反應(yīng)的短潛伏期成分，故判讀易受電刺激偽跡的干擾。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，EABR與聽神經(jīng)病[3]、內(nèi)聽道狹窄[4]、蝸神經(jīng)管狹窄[5]、蝸軸缺如[6]及 Mondini畸形[7]等特殊病例的術(shù)后言語功能的發(fā)展有關(guān)，是一項準(zhǔn)確反映腦干以下聽覺傳導(dǎo)通路完整性、功能性和可塑性的客觀電生理檢查手段，已在臨床廣泛應(yīng)用。Nicolas-Puel[8]等研究發(fā)現(xiàn)，全麻豚鼠圓窗EABR閾值為47.1±4.1μA，其潛伏期約2.56±0.08ms，在本研究中，全麻豚鼠圓窗EABR閾值為0.27±0.05mA，其潛伏期約1.95±0.29ms。

表1 豚鼠EABR III波潛伏期及閾值（n=12）Table 1 Latency and thresholds of EABR III wave in guinea pigs

表2 豚鼠EMLR各波潛伏期及閾值（n=7）Table 2 Latency and thresholds of EMLR waves in guinea pigs

表3 豚鼠ELLR各波潛伏期及閾值（n=7）Table 3 Latency and thresholds of ELLR waves in guinea pigs

與EABR相比，EMLR潛伏期較長，故其受電刺激偽跡的影響較小。中潛伏期反應(yīng)（middle latency response，MLR）是指聽覺誘發(fā)電位在刺激開始后8-100ms出現(xiàn)的反應(yīng)，它反映了聽覺通路中丘腦以至聽皮層等高級中樞的情況，其主要成分包括一系列規(guī)律變化的負(fù)波（Na）、正波（Pa）、負(fù)波（Nb）以及正波（Pb），其中以Pa波最顯著。1958年Geisler首次報道了對人進(jìn)行聽覺誘發(fā)電位中潛伏期反應(yīng)測試(auditory evoked middle latency response，AMLR)[9]。EMLR與AMLR的起源相似，其中Na波起源于下丘腦，Pa波起源于顳葉的初始聽覺皮層[10]，其余波形的起源尚未明確。EMLR波形受刺激位置、刺激參數(shù)、刺激電極、患者年齡、麻醉與睡眠等多種因素的影響[11]。本研究12耳中7耳引出易分辨的EMLR波形，分析未引出的原因可能與測試時豚鼠的麻醉狀態(tài)不同有關(guān)。后續(xù)研究中，可以在監(jiān)測豚鼠麻醉狀態(tài)下進(jìn)行EMLR測試。目前有研究報道豚鼠致聾后EMLR波形變化，但并未提及正常豚鼠EMLR波形的潛伏期和閾值[12]。本研究豚鼠（7耳）圓窗EMLR的閾值為0.29±0.03 mA，Na波的潛伏期為6.40±0.44 ms，Pa波的潛伏期為13.00±1.80 ms，Nb波的潛伏期為25.23±4.72 ms，Pb波的潛伏期為38.05±5.32 ms。

ELLR反映了更高級別聽覺傳導(dǎo)通路的功能。ELLR的主要成分包括P1、N1、P2、N2，其中以P2波最顯著。其中P2起源于初級聽覺皮層[13]。長潛伏期反應(yīng)（late latency responses，LLR）受年齡及受試者狀況的影響[14]，且植入時間越長，振幅越大[15]。目前，關(guān)于ELLR各波的起源及影響因素等尚待進(jìn)一步研究。本研究12耳中7耳引出可分辨的ELLR波形，未引出的原因可能與測試時豚鼠處于麻醉狀態(tài)，對聽覺皮層產(chǎn)生抑制等有關(guān)。在后續(xù)研究中，建議于豚鼠清醒狀態(tài)下進(jìn)行ELLR測試。關(guān)于豚鼠ELLR檢測的研究尚未見報道。本研究豚鼠（7耳）圓窗ELLR的閾值為0.34±0.10 mA，P1波的潛伏期為82.96±17.61 ms，N1波的潛伏期為142.86±21.81 ms，P2波的潛伏期為202.71±20.83 ms，N2波的潛伏期為293.75±21.43 ms。Maurer發(fā)現(xiàn)，EABR和言語識別率的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)度高于LLR[16]。

CI術(shù)后患者言語康復(fù)效果的提高不僅取決于螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量和功能，還取決于聽覺通路的狀態(tài)和功能。因此，我們需要采用EABR、EMLR及ELLR檢測來客觀評估聽覺通路的狀態(tài)和功能，從而在術(shù)前給患者一個心理預(yù)期，減少醫(yī)患矛盾的產(chǎn)生，并可以繼續(xù)用于術(shù)后各個階段測試，客觀評估聽覺傳導(dǎo)通路功能的變化和可塑性。本研究采用蝸外電刺激的方式，記錄到全麻豚鼠分化重復(fù)性良好且穩(wěn)定性較好的圓窗EABR、EMLR、ELLR波形，為EABR、EMLR、ELLR的臨床應(yīng)用提供了參考，有待進(jìn)一步探討和研究。后續(xù)我們將為致聾豚鼠分別行圓窗EABR、EMLR、ELLR測試，為臨床上耳聾患者人工耳蝸植入術(shù)后聽覺言語康復(fù)效果的預(yù)測提供基礎(chǔ)。