巨噬細(xì)胞在內(nèi)耳急性損傷中的作用

陳林軍 韓維舉

中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

聾病教育部重點實驗室

聾病防治北京市重點實驗室

軍事聲損傷防護實驗室（北京100853）

耳蝸Corti器的上皮細(xì)胞對于很多急慢性刺激很敏感，當(dāng)受到急性刺激如聲損傷和耳毒性藥物時，可引起耳蝸Corti器的毛細(xì)胞和與其相連的螺旋神經(jīng)元損傷從而引起聽力下降[1]。目前有研究表明，加劇聲損傷及耳毒性藥物造成的毛細(xì)胞和神經(jīng)元進一步損傷的免疫應(yīng)答中有免疫細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧（ROS）和細(xì)胞因子的參與[2]，很多針對炎癥的干預(yù)治療能有效的減輕炎癥相關(guān)的神經(jīng)性耳聾的損傷水平[3,4]。30年前Fredelius和Rask-Andersen[5]第一次報道了噪聲性耳聾存在耳蝸免疫細(xì)胞的浸潤，近10年間，免疫系統(tǒng)與先前被認(rèn)為“免疫豁免”的耳蝸之間的相互關(guān)系作為一個新興的研究領(lǐng)域，其研究不斷深入。本文重點介紹巨噬細(xì)胞浸潤與聲損傷和耳毒性藥物等急性損傷后引起聽力損失間的關(guān)系。

1 巨噬細(xì)胞在內(nèi)耳的分布

基于內(nèi)耳血迷路屏障阻擋免疫細(xì)胞和大分子免疫蛋白侵入作用的認(rèn)識，既往認(rèn)為內(nèi)耳是“免疫豁免”器官，但近來對內(nèi)耳免疫應(yīng)答的研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)能夠在內(nèi)耳中起反應(yīng)[6-8]，不過研究發(fā)現(xiàn)耳毒性藥物或聲損傷引起的耳蝸炎癥不是針對病原體產(chǎn)生的，該免疫反應(yīng)稱為無菌炎癥[9]。內(nèi)耳的巨噬細(xì)胞包括駐留巨噬細(xì)胞和浸潤巨噬細(xì)胞（標(biāo)記CD163+、IBA1+和CD68+），其主要分布于耳蝸外側(cè)壁、骨螺旋板、螺旋神經(jīng)元和感覺上皮等部位[1,10-14]（圖1）。目前認(rèn)為這些細(xì)胞屬于先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[15]。內(nèi)耳巨噬細(xì)胞在耳蝸生理和病理方面起著重要作用，常駐巨噬細(xì)胞通過監(jiān)視、清除有害物質(zhì)和修復(fù)受損細(xì)胞來保護內(nèi)耳，但適應(yīng)性免疫系統(tǒng)會繼發(fā)釋放破壞性炎性因子導(dǎo)致細(xì)胞破壞、死亡。內(nèi)耳免疫細(xì)胞受聲損傷、耳毒性藥物等急性刺激，誘導(dǎo)血液中的單核細(xì)胞募集到受損的內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)、基底膜和外側(cè)壁[13,16-19]。

圖1 內(nèi)耳巨噬細(xì)胞的分布：蝸螺旋管的分區(qū)，包括鼓階、前庭階及中階。藍色的符號表示內(nèi)耳巨噬細(xì)胞，其分布于螺旋神經(jīng)元、外側(cè)壁及感覺上皮等部位。Fig.1 Distribution of cochlear macrophages.The division of the cochlear which includes scala vestibuli,scala media and scala tympani.Cochlear macrophages are marked by blue star,which distributes in spiral ganglion,lateral wall and sensory epithelium.

2 浸潤巨噬細(xì)胞的類型

CD45最先用于識別聲損傷后浸潤耳蝸的巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物[20]，Hirose[17]結(jié)合CD45的表達和形態(tài)學(xué)特點將大多數(shù)浸潤巨噬細(xì)胞鑒定為單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，隨后發(fā)現(xiàn)聲損傷后浸潤免疫細(xì)胞還包括CD45+、F4/80+、IBA1+、CD11b+和CX3CR1+巨噬細(xì)胞[13,14,20-23]。這些標(biāo)記物對于識別巨噬細(xì)胞群很重要，但并非所有浸潤巨噬細(xì)胞和常駐巨噬細(xì)胞都具有相同特征。通過細(xì)胞分選儀和流式細(xì)胞儀靈敏度的提高將進一步了解這些巨噬細(xì)胞的分子特征。目前滲透到耳蝸的特定細(xì)胞類型的鑒定仍在進行，但已了解這些細(xì)胞在聲損傷或耳毒性藥物等急性刺激后到達耳蝸的時間。

由于聲損傷與耳毒性藥物影響內(nèi)耳免疫系統(tǒng)不盡相同，因此需要了解每種損傷產(chǎn)生免疫應(yīng)答的情況，而通過檢測內(nèi)耳的細(xì)胞因子、Icam-1的表達和巨噬細(xì)胞的浸潤，很難得出內(nèi)耳產(chǎn)生整體免疫應(yīng)答的結(jié)論。目前研究發(fā)現(xiàn)在聲損傷后6h TNF-α、IL-1β、IL-6及CCL2、CCL4、CXCL12即刻表達[4,8,12,20,22,24,25]。損傷后3-4天，耳蝸中CX3CR1+和CD45+細(xì)胞的數(shù)量達到峰值[17,19]。細(xì)胞因子在聲損傷6h后開始表達，這可能是損傷即刻CX3CR1+巨噬細(xì)胞和纖維細(xì)胞活化的結(jié)果[12,19,21,26]。這些細(xì)胞因子的總體作用是誘導(dǎo)耳蝸螺旋神經(jīng)元和外側(cè)壁纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活，從而分泌更多的細(xì)胞因子加重炎癥。

3 常駐巨噬細(xì)胞的作用

Shi[27]發(fā)現(xiàn)在內(nèi)耳存在血管周圍常駐巨噬細(xì)胞，它具有免疫防御、組織修復(fù)及免疫監(jiān)視功能，產(chǎn)生超氧化物陰離子和炎性因子，并清除入侵的病原體、衰老壞死的細(xì)胞。楊[6]等發(fā)現(xiàn)給噪聲后CD45+免疫細(xì)胞主要出現(xiàn)在毛細(xì)胞損傷嚴(yán)重的部位,推測巨噬細(xì)胞在噪聲性耳蝸引起毛細(xì)胞的損傷后發(fā)揮免疫防御及修復(fù)功能。Okano[21]用γ射線照射殺死小鼠內(nèi)耳的骨髓造血細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，然后用內(nèi)源性熒光標(biāo)記的骨髓細(xì)胞移植，可見內(nèi)耳的巨噬細(xì)胞重新構(gòu)建，通過巨噬細(xì)胞形態(tài)與F4/80、IBA-1、CD11b和CD68標(biāo)記染色的巨噬細(xì)胞約占80%[21,28]，說明其是骨髓細(xì)胞來源的，而剩下的20%為常駐巨噬細(xì)胞，且CX3CR1標(biāo)記呈陽性。Sato[23]用GFP敲入破壞CX3CR1信號傳導(dǎo)的CX3CR1gfp/gfp小鼠模型，觀察卡那霉素治療組的耳蝸毛細(xì)胞損失隨浸潤的CD45+細(xì)胞數(shù)量增加而增加。此外將CX3CR1gfp/gfp骨髓移植到野生型小鼠中也出現(xiàn)同樣的情況，表明CX3CR1信號中斷不利于氨基糖苷類藥物暴露后的毛細(xì)胞存活。Kaur[19]發(fā)現(xiàn)用白喉毒素特異性造成毛細(xì)胞丟失的小鼠中，若沒有CX3CR1的表達則螺旋神經(jīng)元的死亡增加?？傊?，這些結(jié)果表明在使用氨基糖苷類藥物后，常駐巨噬細(xì)胞的CX3CR1可能在減少巨噬細(xì)胞浸潤和毛細(xì)胞死亡方面發(fā)揮重要作用。因此，進一步研究CX3CR1+巨噬細(xì)胞對耳蝸損傷的保護作用，對于了解巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)耳蝸損傷后炎癥反應(yīng)中的積極作用具有重要意義。

4 Toll樣受體的激活及免疫調(diào)節(jié)

一些研究表明Toll樣受體4（TLR4）激活是聲損傷、耳毒性藥物刺激后導(dǎo)致耳蝸無菌炎癥的一種途徑[26]。TLR4是一種識別多種配體的模式識別受體（PRR），可在無菌炎癥過程中激活，其下游效應(yīng)是產(chǎn)生ROS和活化NF-κB[29,30]。盡管在這些研究中激活TLR4的確切配體尚不清楚，但受這些因素影響內(nèi)耳均出現(xiàn)TLR4表達的增加[18,26,31]。反過來，TLR4激活又導(dǎo)致 NF-κB 活化和 TNF-α、IL-1β、IL-6的增加[26]。而用脂多糖處理的聲損傷、氨基糖苷類和順鉑藥物的三組小鼠，發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳炎癥增加的同時伴聽力損失的加重，而TLR4缺乏的小鼠內(nèi)耳卻表現(xiàn)出較輕的炎癥及較少的聽力損失[18,26,31]。

目前研究用小鼠模型和藥物來識別內(nèi)耳損傷引起的特定細(xì)胞因子和信號傳導(dǎo)通路。Wakabayashi[4]用IL-6R的中和抗體阻斷聲損傷后釋放的IL-6，發(fā)現(xiàn)在聲損傷3天后CD45+和IBA1+雙陽性細(xì)胞的浸潤顯著減少，同時螺旋神經(jīng)元細(xì)胞死亡減少。此外全身給藥的抗體在聲損傷后可穿過血迷路屏障，這為生物制劑在內(nèi)耳損傷中的應(yīng)用提供了可能。Sun[28]用米諾環(huán)素減少巨噬細(xì)胞的活化，從而降低浸潤巨噬細(xì)胞對毛細(xì)胞的損傷。當(dāng)米諾環(huán)素與新霉素一起給藥時，發(fā)現(xiàn)耳蝸巨噬細(xì)胞浸潤減少的同時毛細(xì)胞死亡減少，聽力損失也減少，這說明阻斷巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥有利于減輕新霉素引起的聽力損失。這些結(jié)果表明通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)可保護耳蝸免受聲損傷及耳毒性藥物損害，說明TLR4受體和炎性細(xì)胞因子的早期刺激在受損后的毛細(xì)胞死亡中起作用，說明存在全身性炎癥影響內(nèi)耳炎癥免疫反應(yīng)的可能。

5 聲損傷后內(nèi)耳的免疫反應(yīng)

當(dāng)組織因非病原體刺激如聲損傷、耳毒性藥物使用，產(chǎn)生的細(xì)胞產(chǎn)物稱為損傷相關(guān)分子模式（DAMP）和模式識別受體（PRR）[32]。這種PRR激活迅速引起常駐巨噬細(xì)胞的激活，釋放促炎細(xì)胞因子和活性氧，誘導(dǎo)受損細(xì)胞凋亡和巨噬細(xì)胞的浸潤[29-33]。DAMP-PRR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的早期炎癥是控制病原體或壞死組織傳播的進化保守機制。首先對炎癥反應(yīng)的是先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，即骨髓來源的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，其試圖通過釋放ROS、吞噬死亡細(xì)胞來消滅死亡的細(xì)胞。其次是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞，其在無菌炎癥部位可識別細(xì)胞損傷產(chǎn)生的自身抗原從而清除受損細(xì)胞[34]。Herranen[35]研究受噪聲刺激的小鼠，發(fā)現(xiàn)其耳蝸外側(cè)壁的應(yīng)激相關(guān)通路如JNK/c-Jun、ERK和NF-κB被激活，造成外毛細(xì)胞的損傷?？梢娛茉肼暬蚨拘运幬锎碳ず螽a(chǎn)生的炎癥信號在毛細(xì)胞死亡中起作用。目前大多數(shù)研究主要集中在預(yù)防炎癥的早期階段，而忽視了免疫系統(tǒng)在炎癥中后期發(fā)揮的調(diào)節(jié)炎癥和促進傷口愈合的作用[36-39]。

6 聲損傷后的內(nèi)耳基因表達

目前研究已從聲損傷后的病理生理變化深入到基因調(diào)控水平，而通過RNA轉(zhuǎn)錄組測序可了解耳蝸整體如何應(yīng)對聲損傷[40]。Gratton較早比較噪聲對易受聲損傷和抗聲損傷的小鼠耳蝸外側(cè)壁和Corti器的影響[41]，發(fā)現(xiàn)在噪聲后易受聲損傷組表達的免疫相關(guān)的基因比抗聲損傷組表達的更多。另外Yang[11]利用RNA測序來比較噪聲后1天的小鼠和大鼠感覺神經(jīng)上皮的基因表達，發(fā)現(xiàn)聲損傷后兩者均表現(xiàn)出免疫應(yīng)答基因的上調(diào)，表明這種基因表達在哺乳動物物種中是保守的。Tan[12]進一步研究聲損傷后多個時間點的免疫應(yīng)答基因和蛋白表達，發(fā)現(xiàn)早在損傷后6h，編碼TNF-a、IL-1β和Icam-1的基因表達增加，且Icam-1蛋白在聲損傷后14天仍高表達。此外盡管這些研究使用了不同的鼠，但幾種參與炎癥反應(yīng)的免疫基因在聲損傷后均有表達[11,12,41]，如 Fos、Socs3、Gpb2、Icam-1 和 CCR2。Socs3可表達降解信號分子來抑制JAK/STAT依賴性細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)[42]，調(diào)節(jié)浸潤巨噬細(xì)胞的吸附和常駐巨噬細(xì)胞的活化。Icam-1在TNF-α引起NF-κB活化后表達，通過與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原的相互作用促進血液中的細(xì)胞外滲，使巨噬細(xì)胞進入耳蝸[43]。Fos和Gbp2在聲損傷后由干擾素誘導(dǎo)激活STAT通路[44-45]。CCR2缺乏的小鼠表現(xiàn)出極大的聲損傷易感性，聲損傷后伴毛細(xì)胞的大量死亡[46]。盡管聲損傷后在耳蝸中可檢測到相關(guān)免疫基因的大量表達，但可能只是一部分細(xì)胞類型上調(diào)了這些基因。因此識別這些細(xì)胞類型將能夠特異性地了解它們對毛細(xì)胞的損傷機理。

7 巨噬細(xì)胞在內(nèi)耳研究中的現(xiàn)狀和展望

現(xiàn)在已認(rèn)識到耳蝸內(nèi)存在著免疫細(xì)胞，但對其在維持耳蝸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和參與炎癥調(diào)控中的作用機制的認(rèn)知仍不足。當(dāng)前對內(nèi)耳免疫系統(tǒng)的研究主要集中于聲損傷、耳毒性藥物刺激后內(nèi)耳TLR4激活、促炎細(xì)胞因子和趨化因子的釋放以及浸潤巨噬細(xì)胞的聚集，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)可減輕內(nèi)耳炎癥產(chǎn)生的損傷。因此目前應(yīng)通過以下幾方面更多地了解聲損傷和耳毒性藥物損傷后內(nèi)耳的免疫應(yīng)答的機理。首先，識別所有進入耳蝸的免疫細(xì)胞類型。其次，探索其特定功能，以了解其分泌產(chǎn)物和細(xì)胞間的相互作用是如何引起內(nèi)耳的炎癥反應(yīng)。最后，研究每個PRR家族以更好地明確哪些DAMP在損傷后引起內(nèi)耳炎癥反應(yīng)。這些研究結(jié)果能加深對耳蝸“無菌炎癥”免疫應(yīng)答的認(rèn)識，同時指出耳毒性藥物和噪聲引起的聽力損失的預(yù)防性治療位點。