兒童GJB2基因p.V37I位點(diǎn)突變與耳聾臨床表型的相關(guān)性研究

王現(xiàn)蕾 王雪瑤 趙雪雷 程曉華 黃麗輝

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 北京市耳鼻咽喉科研究所耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100005）

GJB2基因突變是引起遺傳性非綜合征型聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL）的主要因素，其基因突變具有明顯的種族差異性，亞洲地區(qū)以c.235delC突變最為常見(jiàn)[1]，近期研究發(fā)現(xiàn)，p.V37I(c.109G＞A)突變?cè)趤喼薜臄y帶率也很高[2]，p.V37I突變最初被認(rèn)為是單核苷酸基因多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）[3]，之后研究發(fā)現(xiàn)其與遲發(fā)性聽(tīng)力損失密切相關(guān)[2]。本課題組前期曾發(fā)現(xiàn)20例GJB2基因p.V37I雜合突變兒童中，19例出現(xiàn)輕、中度感音神經(jīng)性耳聾[4]，本研究對(duì)GJB2基因p.V37I位點(diǎn)突變兒童的臨床聽(tīng)力學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行分析，比較不同基因型突變兒童聽(tīng)力學(xué)表型的差異，進(jìn)一步探討GJB2基因p.V37I基因突變的臨床意義，為遺傳咨詢提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2012年至2018年間，于我院兒童聽(tīng)力診斷中心就診，接受新生兒耳聾基因篩查及GJB2基因全編碼區(qū)測(cè)序的兒童812例，檢出c.235delC/p.V37I、c.299delAT/p.V37I及c.176del16/p.V37I復(fù)合雜合突變47例，共納入資料完整者41例。其中男26例、女15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1.接受新生兒耳聾基因篩查及GJB2基因全編碼區(qū)檢測(cè)，確診為GJB2基因c.235delC/p.V37I、c.299delAT/p.V37I及c.176del16/p.V37I復(fù)合雜合突變者；2.接受新生兒聽(tīng)力篩查(universal newborn hearing screening,UNSH)并有明確結(jié)果者；3.已進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)、聽(tīng)性穩(wěn)態(tài)反應(yīng)（auditory steady-state response,ASSR)、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion production otoacoustic emission,DPOAE)、聲導(dǎo)抗(acoustic immittance,AI)和小兒行為測(cè)聽(tīng)等聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)者；4.聽(tīng)力正?；蚋幸羯窠?jīng)性聾者。

1.2 測(cè)試方法

1.2.1 耳聾基因檢測(cè)

首先進(jìn)行血液基因組DNA提取，然后根據(jù)樣本量計(jì)算需配制的PCR擴(kuò)增體系，選自目的片段擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Big Dye v3.1測(cè)序試劑說(shuō)明書(shū)配置測(cè)序體系，并按特定測(cè)序程序進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，然后按3730xl DNA分析儀標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)操作進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。最后將測(cè)序峰圖文件導(dǎo)入SMD軟件，使用軟件識(shí)別測(cè)序結(jié)果（包括雜合位點(diǎn)），去除峰圖兩端的低質(zhì)量序列，并將高質(zhì)量序列與目的基因的參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出突變位點(diǎn)并進(jìn)行注釋。

1.2.2 聽(tīng)力測(cè)試

1.2.2.1 聲導(dǎo)抗

應(yīng)用美國(guó)GSI–Tympstar中耳分析儀。探采用226 Hz和1 k Hz、85 dB SPL探測(cè)音，外耳道壓力從+200daPa向-400daPa方向變化，壓力變化速率為50daPa/s。測(cè)試時(shí)選擇合適的探頭，使其與耳道口密閉良好。226Hz探測(cè)音鼓室圖根據(jù)Li den-Jerger分型對(duì)鼓室圖進(jìn)行分類：A型（包括As和Ad兩個(gè)亞型）、B型和C型。1kHz根據(jù)有無(wú)峰及峰的數(shù)目對(duì)圖形進(jìn)行分類：?jiǎn)畏逍汀㈦p峰型、平坦型。

1.2.2.2 ABR測(cè)試

采用美國(guó)Nicolet公司生產(chǎn)的Spirit誘發(fā)電位儀，于符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的電屏蔽隔聲室進(jìn)行。根據(jù)小兒體重服用一定量6.5%水合氯醛溶液，于睡眠狀態(tài)下測(cè)試。刺激聲為交替極性的短聲(click)，脈寬0.1ms，刺激聲起始強(qiáng)度80dB nHL，刺激重復(fù)率19.9次/s，分析時(shí)間12 ms，帶通濾波100-3000 Hz，疊加次數(shù)1000次。電極：前額為記錄電極，聲刺激側(cè)乳突為參考電極，眉間為接地電極。

1.2.2.3 DPOAE測(cè)試

使用英國(guó)Otodynamics公司生產(chǎn)的IL092型耳聲發(fā)射儀，測(cè)試條件：同時(shí)使用2個(gè)刺激純音f1、f2，強(qiáng)度f(wàn)l=f2=70 dB，f2:fl=1.22；刺激聲岔的頻率點(diǎn)為696、1001、1501、2002、3003、4004、5005 和 6006 Hz。DPOAE的正常標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)分析頻率點(diǎn)畸變產(chǎn)物(distortion product，DP)的值在正常范圍內(nèi)，同時(shí)該頻率點(diǎn)的幅值大于該點(diǎn)噪聲6 dB。

1.2.2.4 ASSR測(cè)試

應(yīng)用丹麥Eclipse ASSR誘發(fā)電位儀，于符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的電屏蔽隔聲室進(jìn)行。采用ASSR常規(guī)參數(shù)設(shè)置，刺激聲頻率為：0.5kHz、1kHz、2kHz及4kHz。根據(jù)小兒公斤體重服用一定量10%水合氯醛溶液，于睡眠狀態(tài)下測(cè)試。

1.2.2.5 小兒行為測(cè)聽(tīng)

應(yīng)用丹麥爾聽(tīng)美Conera純音聽(tīng)力計(jì)，插入式耳機(jī)ER-3A。在符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)即環(huán)境噪聲＜20dB(A)的隔聲室進(jìn)行。根據(jù)嬰幼兒年齡及發(fā)育狀況選擇行為觀察測(cè)聽(tīng)(behavioral observation audiometry,BOA)、視覺(jué)強(qiáng)化測(cè)聽(tīng)(visual reinforcement audiometry,VRA)、游戲測(cè)聽(tīng)(play audiometry,PA)。測(cè)試中測(cè)試者和誘導(dǎo)觀察者相互配合，使小兒建立良好的條件反射，獲得小兒行為聽(tīng)閾。

1.3 分析方法

1.3.1 研究對(duì)象分組

本研究按照新生兒耳聾基因篩查及GJB2基因全編碼區(qū)檢測(cè)結(jié)果將研究對(duì)象分為3組，分別為c.235delC/p.V37I、c.299delAT/p.V37I及c.176del16/p.V37I復(fù)合雜合突變組，對(duì)3組兒童聽(tīng)力篩查通過(guò)率、聽(tīng)力損失程度及聽(tīng)力曲線分型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析其差異。

1.3.2 聽(tīng)力損失程度分級(jí)

按照WHO(1997)制定標(biāo)準(zhǔn)[5]，以小兒行為測(cè)聽(tīng)氣導(dǎo)0.5kHz,1kHz,2kHz,4 kHz平均聽(tīng)閾評(píng)估聽(tīng)力損失程度分級(jí)。聽(tīng)力損失分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：輕度：26-40dB HL，中度：41-60dB HL，重度：61-80dB HL，81dBHL以上為極重度聽(tīng)力損失。

本研究將無(wú)法配合小兒行為測(cè)聽(tīng)的患兒，運(yùn)用ASSR聽(tīng)反應(yīng)閾與行為測(cè)聽(tīng)預(yù)估聽(tīng)閾聽(tīng)敏度校正因子將正常聽(tīng)力級(jí)(nHL)換算為預(yù)估聽(tīng)力級(jí)(eHL)。預(yù)估聽(tīng)力級(jí)為依據(jù)電生理測(cè)試的聽(tīng)反應(yīng)閾所預(yù)估的純音聽(tīng)閾(HL)。若雙耳聽(tīng)力損失程度不一致，以聽(tīng)力損失較輕耳別統(tǒng)計(jì)例數(shù)。

1.3.3 聽(tīng)力曲線分型

根據(jù)Mazzoli等[6]提出的對(duì)聽(tīng)力曲線描述，將其分為：高頻下降型（包括緩降型和陡降型）、平坦型、上升型和U型。且當(dāng)最大聲輸出無(wú)反應(yīng)時(shí)，默認(rèn)為聽(tīng)力圖無(wú)法判別。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

根據(jù)新生兒耳聾基因篩查及GJB2基因全編碼區(qū)檢測(cè)結(jié)果，共納入GJB2基因包含c.235delC、c.299delAT、c.176del16和p.V37I復(fù)合雜合突變兒童41例，其中男26例、女15例，所有兒童均攜帶p.V37I雜合突變(表1)，年齡范圍：3-78個(gè)月；平均年齡：27.6±19.1個(gè)月；中位年齡：28個(gè)月。首診年齡范圍：2-24個(gè)月，平均首診年齡：5.3±4.0個(gè)月，中位首診年齡：4個(gè)月。1例兒童有家族史，所有兒童均無(wú)出生及母孕期異常。

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)新生兒耳聾基因篩查及GJB2基因全編碼區(qū)檢測(cè)，共檢出3種基因型，以c.235delC/p.V37I復(fù)合雜合突變?yōu)橹?，?5例，占60.98%。其余兩種基因型分別為c.299delAT/p.V37I，共13例，占31.71%；c.176del16/p.V37I，共 3例，占 7.31%，未檢出c.35delG突變位點(diǎn)。

2.3 新生兒聽(tīng)力篩查及聽(tīng)力診斷結(jié)果

所有兒童均接受新生兒聽(tīng)力篩查及聽(tīng)力診斷。新生兒聽(tīng)力篩查通過(guò)13例（31.7%），未通過(guò)28例（68.3%）。經(jīng)聽(tīng)力診斷，聽(tīng)力正常16例（39.0%），聽(tīng)力損失25例（61.0%），均為雙側(cè)感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失。25例聽(tīng)力損失患兒中，輕度14例（56.0%）、中度11例（44.0%），無(wú)重度、極重度聽(tīng)力損失。13例通過(guò)聽(tīng)力篩查的新生兒中，3例（23.0%）之后確診為輕度聽(tīng)力損失,1例（7.7%）確診為中度聽(tīng)力損失；25例未通過(guò)聽(tīng)力篩查的新生兒中，7例（28.0%）之后診斷為聽(tīng)力正常（表1）。

表1 兒童基本信息及聽(tīng)力結(jié)果Table 1 Demographic information and audiological diagnoses of subjects

2.4 基因型與臨床聽(tīng)力學(xué)特點(diǎn)

2.4.1 基因型與聽(tīng)力篩查

c.235delC/p.V37I及c.299delAT/p.V37I突變者，新生兒聽(tīng)力篩查結(jié)果均以未通過(guò)為主，分別為18例（72.7%）、9例（66.7%）。c.176del16/p.V37I兒童新生兒聽(tīng)力篩查通過(guò)2例（66.7%），未通過(guò)1例（33.3%）（表2）。

2.4.2 基因型與聽(tīng)力診斷

c.235delC/p.V37I突變者，聽(tīng)力正常12例（48.0%，12/25），聽(tīng)力損失13例（52.0%，13/25），以輕度為主。c.299delAT/p.V37I突變者，聽(tīng)力正常3例（23.0%，3/13），聽(tīng)力損失為10例（77.0%，10/13），以中度為主，共6例（60.0%，6/10）。c.176del16/p.V37I突變者，聽(tīng)力正常1例，聽(tīng)力損失2例，其中輕度聽(tīng)力損失1例，中度聽(tīng)力損失1例（表3）。

25例聽(tīng)力損失者，50例患耳中聽(tīng)力損失曲線類型由多到少依次為：平坦型29耳(58.0%)，高頻下降型12耳(24.0%)，U型 6耳(12.0%)，上升型3耳(6.0%)。 c.235delC/p.V37I、c.299delAT/p.V37I 及c.176del16/p.V37I三組均以平坦型為主，分別占61.5%、55.0%及50.0%（表4）。

表2 三種基因型聽(tīng)力篩查結(jié)果（例，%）Table 2 Results of hearing screening across three groups(case,%)

表3 三種基因型聽(tīng)力程度結(jié)果（例，%）Table 3 Result of degree of hearing loss across three groups（case,%）

表4 三種基因型聽(tīng)力曲線結(jié)果（耳，%）Table 4 Curve type of hearing loss across three groups（ear,%）

3 討論

耳聾是最常見(jiàn)的先天性感覺(jué)障礙，其發(fā)病率在新生兒中約占1/500，在4歲以上的兒童中則上升至 1/300[7]。1997年，Kelsell等[8]首次提出GJB2基因與NSHL相關(guān)。此后研究證明，GJB2基因是NSHL最常見(jiàn)的致病基因[9]，中國(guó)學(xué)者報(bào)道在常染色體隱性遺傳的耳聾患者中，約50%由GJB2基因突變引起[10]。迄今為止，已有300多種GJB2基因突變，被報(bào)道導(dǎo)可導(dǎo)致隱性非綜合征型聾（DFNB1）（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/）。2003年紀(jì)育斌等[11]通過(guò)對(duì)中國(guó)非綜合征型聾病患者GJB2基因突變的流行病學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)GJB2基因突變最常見(jiàn)的4種類型分別為c.235delC、c.299delAT、c.176del16和c.35delG，在我國(guó)耳聾人群中，這4個(gè)位點(diǎn)的突變率分別為11.90%、2.22%、0.65%和0.27%。值得注意的是，p.V37I位點(diǎn)突變?cè)趤喼奕巳褐械耐蛔兟室埠芨遊2]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)p.V37I突變表現(xiàn)為輕度至極重度聽(tīng)力損失，輕-中度聽(tīng)力損失所占比例超過(guò)60%[4,12]。吳皓等[13]的研究發(fā)現(xiàn)GJB2基因p.V37I突變?cè)跐h族遲發(fā)性聽(tīng)力損失患兒組中的發(fā)生率為20%，遠(yuǎn)高于聽(tīng)力正常兒童組，提示p.V37I突變與遲發(fā)性聽(tīng)力損失關(guān)系密切。2012年，北京率先開(kāi)始在本市實(shí)施常駐人口的耳聾基因篩查項(xiàng)目，對(duì)GJB2基 因 c.235delC、c.299delAT、c.176del16和c.35delG位點(diǎn)突變進(jìn)行篩查，篩查結(jié)果為GJB2基因單雜合突變患兒可于聽(tīng)力診斷機(jī)構(gòu)進(jìn)行GJB2基因全外顯子測(cè)序，c.235delC/p.V37I、c.299delAT/p.V37I等復(fù)合雜合突變患兒的檢出日益增多，本研究通過(guò)對(duì)41例GJB2基因p.V37I位點(diǎn)突變兒童的臨床聽(tīng)力學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行分析，探討p.V37I雜合突變的臨床意義，為遺傳咨詢提供臨床依據(jù)。

3.1 基因檢測(cè)結(jié)果

GJB2基因在內(nèi)耳中的正常表達(dá)是內(nèi)耳感覺(jué)細(xì)胞和支持細(xì)胞間進(jìn)行離子和信息傳遞的基礎(chǔ)，對(duì)內(nèi)耳發(fā)育和聽(tīng)覺(jué)形成至關(guān)重要，不同種族，基因突變譜系不同。GJB2基因突變?cè)诒睔W猶太教徒、高加索人中，出現(xiàn)頻率較多的基因位點(diǎn)突變分別是c.35delG、c.167delT和c.235delC[14]。在亞洲，c.235delC是最常見(jiàn)的位點(diǎn)突變，突變率為5～22%[15-17]，p.V37I在中國(guó)漢族人群中的攜帶率也很高，Li等報(bào)道為6.2%[2]。Dai[18]等報(bào)道在2063例非綜合征性感音神經(jīng)性聾患者中，p.V37I純合突變檢出率為6.8%，與正常對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為p.V37I突變具有致病性。本課題組前期對(duì)915例GJB2基因篩查為單雜合突變的新生兒進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)p.V37I突變檢出率為4.04%[19]。本研究對(duì)檢出的p.V37I雜合突變不同基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)基因型為c.235delC/p.V37I，占61.0%（25/41），其次為 c.299delAT/p.V37I，占31.7%（13/41），c.176del16/p.V37I，占7.3%（3/41），未檢出c.35delG/p.V37I，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

3.2 聽(tīng)力篩查情況

Wu[20]等使用DPOAE或AABR，對(duì)62名基因型為p.V37I/p.V37I的新生兒及16名基因型為p.V37I/c.235delC的新生兒進(jìn)行聽(tīng)力篩查，通過(guò)率分別為51.6%和62.5%，本研究新生兒聽(tīng)力篩查通過(guò)率為31.7%（13/41），其中 p.V37I/c.235delC通過(guò)率為28.0%（7/25），低于上述報(bào)道，可能與基因型、新生兒聽(tīng)力篩查方式、篩查人員技術(shù)等因素有關(guān)。此外，Li[2]等對(duì)173名聽(tīng)力篩查未通過(guò)，之后確診為聽(tīng)力正常的兒童進(jìn)行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)p.V37I突變檢出率為5.8%（10/173），遠(yuǎn)高于聽(tīng)力篩查通過(guò)組（0.14%），認(rèn)為p.V37I復(fù)合雜合突變兒童在出生時(shí)可能存在亞臨床或交界性聽(tīng)力損失。本研究有7例兒童（17.1%，7/41）聽(tīng)力篩查未通過(guò)，之后確診為聽(tīng)力正常，考慮除上述研究提出的原因外，可能與部分新生兒在接受聽(tīng)力篩查時(shí)耳蝸毛細(xì)胞發(fā)育相對(duì)不完善，影響耳聲發(fā)射的測(cè)試結(jié)果；或部分新生兒在接受聽(tīng)力篩查時(shí)存在中耳積液等因素有關(guān)，因樣本量較少，需擴(kuò)大樣本量，對(duì)原因進(jìn)行深入探討。

3.3 聽(tīng)力診斷情況

Wu等[20]對(duì)35名基因型為c.235delC/p.V37I的受試兒進(jìn)行聽(tīng)力隨訪，發(fā)現(xiàn)1歲時(shí)，54.2%（19/35）的受試兒聽(tīng)力程度＜25dB HL，提示GJB2基因c.235delC/p.V37I復(fù)合雜合突變有一定非外顯率，本研究受試者于3月齡后進(jìn)行聽(tīng)力診斷，聽(tīng)力正常16人(39.0%，16/41)，略低于Wu的報(bào)道，分析原因，可能為本研究入組對(duì)象基因型不同有關(guān)。除c.235delC/p.V37I外，本研究還包含c.299delAT/p.V37I、c.176del16/p.V37I基因型，不同基因型在聽(tīng)力診斷時(shí)具有聽(tīng)力表型的差異。諸多研究表明，p.V37I突變與輕度至中度聽(tīng)力損失密切相關(guān)[4,12]，本研究結(jié)果顯示，輕度聽(tīng)力損失14人（34.1%，14/41），中度聽(tīng)力損失11人（26.8%，11/41），無(wú)重度、極重度感音神經(jīng)性聾者，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。值得注意的是，通過(guò)對(duì)不同基因型兒童的聽(tīng)力診斷情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)c.299delAT/p.V37I突變兒童聽(tīng)力損失10人（76.9%，10/13），聽(tīng)力損失程度以中度為主，提示c.299delAT/p.V37I突變兒童出現(xiàn)聽(tīng)力損失可能性較c.235delC/p.V37I及c.176del16/p.V37I突變兒童大且聽(tīng)力損失程度更重，需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行臨床深入研究。本研究3名（8.82%，3/34）兒童通過(guò)聽(tīng)力篩查，在3月齡后聽(tīng)力診斷時(shí)，出現(xiàn)雙側(cè)輕度聽(tīng)力損失，提示其可能發(fā)生遲發(fā)性聽(tīng)力損失，與以往報(bào)道相同[13]。3組基因型聽(tīng)力曲線均以平坦型為主，U型與上升型較少，與代志瑤等[21]對(duì)GJB2基因突變陽(yáng)性者聽(tīng)力曲線類型的報(bào)道基本一致。

研究發(fā)現(xiàn)，本組GJB2基因p.V37I雜合突變兒童，基因型以c.235delC/p.V37I為主，61.0%出現(xiàn)輕-中度聽(tīng)力損失。4例兒童通過(guò)新生兒聽(tīng)力篩查，之后出現(xiàn)聽(tīng)力損失，提示GJB2基因p.V37I突變與遲發(fā)性聽(tīng)力損失相關(guān)?；蛐蜑閏.299delAT/p.V37I的兒童出現(xiàn)聽(tīng)力損失可能性較大，臨床應(yīng)予以重視。