聽性腦干反應(yīng)各波幅度的測量方法-動物實驗研究

楊媛媛 時晰 胡洪義 陶源 郭維維 陳偉 冀飛*

1北京大學(xué)深圳醫(yī)院耳鼻咽喉科（深圳 518036）

2中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所，耳鼻咽喉頭頸外科國家臨床研究中心，聾病教育部重點實驗室，聾病防治北京市重點實驗室，軍事聲損傷防護實驗室，老年共病國家臨床研究中心（北京100853）

3徐州醫(yī)科大學(xué)聽覺與平衡醫(yī)學(xué)研究所（徐州 221004）

聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response,ABR）是聽神經(jīng)纖維的同步化反應(yīng)，在聽神經(jīng)受到聲刺激后的10 ms內(nèi)出現(xiàn)5至7個波（I-VII）。ABR是進行客觀聽功能評估的重要手段。在臨床上，ABR各波的潛伏期和波間期應(yīng)用較為廣泛。近年來隨著對隱性聽力損失這一疾病認識的深入和臨床診斷需要，ABR波幅特別是I波幅度的應(yīng)用受到關(guān)注[1,2]。準(zhǔn)確而穩(wěn)定地測量I波幅度，進而確定I波的正常參考值范圍，是隱性聽力損失的臨床診斷急需解決的問題之一。對于，常用的ABR波幅測量方法有兩種：一種是量取波峰與波谷之間的差值，一種是波峰與基線的差值（圖1）。兩種方法目前在臨床上均有采用。本文旨在利用聽覺病理生理實驗常用的實驗動物豚鼠，對兩種波幅測量方法進行分析比較，為臨床ABR測試提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2-3月齡SPF級標(biāo)準(zhǔn)的健康白毛雌性豚鼠11只（22耳），體重250-300g，耳廓反射正常，由解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供，研究符合解放軍總醫(yī)院倫理委員會相關(guān)動物試驗相關(guān)規(guī)定。

1.2 ABR檢測

本研究采用美國TDT測聽設(shè)備（TDT,Alachua,Florida,美國）和Biosig測聽軟件進行ABR測試。測聽在隔聲屏蔽室內(nèi)進行，測聽前使用1%戊巴比妥(40 ml/kg,腹腔注射)對豚鼠進行麻醉。記錄電極置于兩側(cè)耳廓前緣連線中點皮下，參考電極置于測試耳耳后皮下，接地電極置于對側(cè)耳耳后皮下。發(fā)聲揚聲器距外耳道口約0.5cm。實驗采用短聲(Click)和 4k、8k、12k、16k、24k、32k Hz短純音(Tone burst，上升/下降時間 1 ms，平臺 4 ms)作為刺激聲，帶通濾波為300-3000Hz，疊加次數(shù)為1024次，掃描時間10ms。刺激聲強度自最大刺激強度（90 dB SPL）開始，以10 dB為步距逐漸遞減，直至檢測不出重復(fù)的ABR波形，再向上遞增5 dB，直至能檢測出重復(fù)的ABR波形，以能分辨出可重復(fù)的ABR波Ⅲ的最低刺激強度判斷閾值。分別測量90 dB SPL各種刺激信號引出的ABR波I、波III的潛伏期、波間期。分別以兩種方法測量各波波幅。一種是測量波峰至隨后的波谷之間的幅度差值，一種是測量波峰至基線之間的差值（圖1）?；€的確定從施加刺激信號的時間（0 ms）開始，平行于時間軸。幅度差值均以垂直于基線的方向進行測量。

圖1 豚鼠ABR波幅的兩種測量方法Fig.1 TwoABR waveform amplitude measurement methods

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25和MedCalc軟件進行統(tǒng)計分析。分析本組樣本的反應(yīng)閾、潛伏期及波間期；ABR波I、III、V波幅及波I/V在90dB SPL刺激聲強下各頻率的兩種測量方法穩(wěn)定性的比較，本文對同一組樣本進行兩種波幅的測量方法的比較，且兩種方法目前尚無金標(biāo)準(zhǔn)，因此需采用Bland-Altman一致性分析方法，比較兩種波幅測量方法的結(jié)果是否一致，（P＜0.05,說明二者不一致，即兩種方法不能互換），并用MedCalc軟件繪制Bland-Altman圖，橫坐標(biāo)表示兩種波幅測量方法的均值，縱坐標(biāo)表示兩種波幅測量方法的差值。再分別對兩種波幅測量方法所得的數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，根據(jù)數(shù)據(jù)是否滿足正態(tài)分布分別采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)（四分位數(shù)間距）進行兩組數(shù)據(jù)離散程度的比較，并做散點圖可視化描述兩種測量方法的離散趨勢。采用變異系數(shù)評估兩種測量方法下波I波幅與波I/V的離散程度。

2 實驗結(jié)果

2.1 ABR反應(yīng)閾、各頻率刺激聲在90dB SPL刺激聲強下波I、III、波V的潛伏期及波間期

豚鼠的ABR在90dB SPL聲強下，波形分化良好，采用波III來判斷反應(yīng)閾。短聲（Click）、短純音（4k、8k、12k、16k、24k、32kHz）刺激聲下，ABR反應(yīng)閾分別為：26.14±7.86dB、18.86±5.96dB、17.50±6.50dB、23.64±6.20dB、25.45±7.39dB、41.59±7.78dB、47.05±6.30dB SPL。在短純音8kHz時ABR閾值最低。各刺激聲在90dB SPL聲強下波I、波III、波V的潛伏期及波間期結(jié)果如表1所示。

表1 90dB SPL刺激聲強下不同頻率的ABR的參數(shù)比較（x±s，n=22）Table 1 ABR parameters of various frequency under 90dB SPL（x±s，n=22）

2.2 90dB SPL刺激聲強下各頻率ABR波I、波III、波V兩種波幅測量方法的比較

利用Blang-Altman法分析90dB SPL聲強下各頻率波I、波III、波V的兩種波幅測量方法的一致性。波I（表2、圖2）波III（表2、圖3）和波V（表2、圖4）的兩種波幅測量方法所得結(jié)果均不一致，P值均＜0.01，即二種方法之間不能互換。正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示，波I、波III、波V各頻率的方法1與方法2均滿足對稱分布，通過比較波I、波III、波V波幅兩種測量方法的標(biāo)準(zhǔn)差（表2），可見方法2的標(biāo)準(zhǔn)差更小，因此推測得出波I、波III、波V波幅的測量方法2較方法1分布更集中，更穩(wěn)定。做散點圖（圖6A、B、C），直觀比較兩種測量方法的離散趨勢。

圖2 利用Blang-Altman法分析90dB SPL刺激聲強下不同頻率ABR波I兩種波幅測量方法一致性的分析結(jié)果（n=22）Fig.2 The two methods’agreement of ABR wave I amplitudes under 90dB SPL various frequency using Blang-Altman analysis（n=22）

表2 Blang-Altman分析90dB SPL刺激聲強下各頻率ABR波I、波III、波V兩種波幅測量方法一致性的分析結(jié)果（n=22）Table 2 The two methods’agreement ofABR wave I,wave III,wave V amplitudes under 90dB SPL various frequency by Blang-Altman analysis(n=22)

圖3 利用Blang-Altman法分析90dB SPL刺激聲強下不同頻率ABR波III兩種波幅測量方法一致性的分析結(jié)果（n=22）Fig.3 The two methods’agreement of ABR wave III amplitudes under 90dB SPL various frequency using Blang-Altman analysis（n=22）

圖4 利用Blang-Altman法分析90dB SPL刺激聲強下不同頻率ABR波V兩種波幅測量方法一致性的分析結(jié)果（n=22）Fig.4The two methods’agreement of ABR wave V amplitudes under 90dB SPL various frequency using Blang-Altman analysis（n=22）

2.3 90dB SPL刺激聲強下各頻率ABR兩種波幅測量方法波I/V波幅比的比較

利用Blang-Altman法比較方法1、方法2得到的的I/V波幅比的一致性,結(jié)果顯示兩種測量方法得到的結(jié)果不一致，P＜0.01（圖5，表3）。SPSS25行正態(tài)檢驗，部分數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布及對稱分布，采用四分位間距比較二者的差異（表3），并行散點圖直觀比較二者的離散程度（圖6D）。得出方法2的四分位間距均小于方法1，即方法2的I/V波幅比離散程度更小，更穩(wěn)定。

圖5 利用Blang-Altman法分析90dB SPL刺激聲強下不同頻率ABR I/V波幅比的兩種波幅測量方法一致性的分析結(jié)果（n=22）Fig.5 The two methods’agreement of amplitude ratio ABR wave I/V under 90dB SPL various frequency using Blang-Altman analysis（n=22）

2.4 90dB SPL刺激聲強下各頻率ABR兩種測量方法的波I波幅與I/V波幅比的穩(wěn)定性比較

SPSS25統(tǒng)計90dB SPL刺激聲強下各頻率ABR兩種測量方法的波I波幅與I/V波幅比，采用變異系數(shù)分析波I波幅與波I/V的離散程度（表4），得出方法1及方法2的波I波幅分布更集中，離散度更小，較波I/V更穩(wěn)定。

表3 Blang-Altman分析90dB SPL刺激聲強下各頻率ABR波I/V波幅比兩種波幅測量方法一致性的分析結(jié)果（n=22）Table 3 The two methods’agreement ofABR wave I/V amplitude ratio under 90dB SPL various frequency by Blang-Altman analysis(n=22)

圖6 90dB SPL刺激聲強下各頻率ABR波I、波III、波V、波I/V兩種波幅測量方法的離散趨勢比較（n=22）Fig.6 The tendency of dispersion of ABR wave I、III、V amplitudes and amplitude ratio wave I/V by two methods under 90dB SPL various frequency

3 討論

ABR是聽神經(jīng)纖維的同步化反應(yīng)，在臨床和基礎(chǔ)實驗中均有廣泛應(yīng)用。已關(guān)注較多的分析指標(biāo)多為各波的潛伏期和波間期，以及ABR的閾值（人類為V波、小鼠為II波、豚鼠為III波）。以往對波幅的分析由于受到影響因素較多應(yīng)用較為局限。但近年來對隱性聽力損失（hidden hearing loss,HHL）的研究逐漸深入并貼近臨床，ABR波幅特別是I波幅度因其在隱性聽力損失的臨床診斷中的重要作用而重新受到關(guān)注[1,2]。隱性聽力損失[3]臨床上表現(xiàn)為患者在噪聲環(huán)境中言語識別率下降、耳鳴、聽覺過敏、聲源定位、音樂感知變差等，常規(guī)測試頻率（0.25-8KHz）的純音聽閾正常。研究顯示，低自發(fā)放電率、高閾值的聽神經(jīng)纖維損傷是隱性聽力損失最主要的損傷機制[4,5]。這種損傷早于毛細胞的損傷，且并不影響ABR的閾值，但對較高聲壓級信號的時間和強度編碼以及對抗連續(xù)背景噪聲掩蔽的能力有損害[6]。通常認為ABR的I波來源于聽神經(jīng)近耳蝸端的動作電位。聽神經(jīng)細胞靜息時處于極化狀態(tài)，當(dāng)受到刺激，神經(jīng)細胞膜去極化達到或超過閾電位時，即可在極短的時間內(nèi)產(chǎn)生動作電位，經(jīng)歷去極化、復(fù)極化、超極化過程，即動作電位的上升支、峰電位、下降支、負后電位、正后電位的過程[7]。

目前臨床上對隱性聽力損失的聽力學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)未統(tǒng)一[8]?；谏鲜鰮p傷機制以及ABR的波形成分來源，I波的幅度是一個較好的診斷指標(biāo)。臨床上，對于純音聽閾測試正常的有聽力學(xué)改變主訴的患者，比如耳鳴或有噪聲接觸史的患者，ABR除了關(guān)注閾值、潛伏期及波間期外，更要關(guān)注ABR波幅有無變化。除了測量I波的絕對幅度，也可使用波I/V幅度比[1,9,10,11]。對于正常聽力的耳鳴患者，有報道稱ABR波I波幅下降[1,11-14]，但對ABR其他波的波幅變化報道不盡相同，比如Schaette R等和Bramhall NF等發(fā)現(xiàn)ABR波III、波V波幅無明顯變化，波I/V比值下降[1,11]；Gu JW報道ABR波III、波V波幅增大[12]；Konadath S發(fā)現(xiàn)波V波幅下降[14]。對于有噪聲接觸史的患者，Valderrama JT Bramhall NF報道聽力正?；蚪咏５氖勘佑|噪聲時間越長，ABR波I波幅下降越明顯[15-17]。在嚙齒類動物也得出類似的結(jié)論[18,19]。但也有學(xué)者發(fā)些噪聲暴露后ABR波I波幅無變化[20,21]。目前本文只探討了正常豚鼠的ABR波幅的兩種測量方法，并沒有在隱性聽力損失動物模型中進行測量分析，在后續(xù)工作中，我們將進一步研究。

表4 90dB SPL刺激聲強下各頻率ABR兩種測量方法的波I波幅與波I/V的變異系數(shù)比較Table 4 The CV of ampllitude wave I and amplitude ratio ofABR wave I/V by two methods under 90dB SPL various frequency(n=22)

如果要確立明確的隱性聽力損失臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，I波幅度的準(zhǔn)確測量至關(guān)重要。但相對于潛伏期，ABR波幅受到的影響因素很多，可能與螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)量、年齡、突觸數(shù)量、刺激聲強、刺激聲頻率、反應(yīng)閾、性別、噪聲接觸時間等有關(guān)。在動物的研究中發(fā)現(xiàn)ABR波I波幅與螺旋神經(jīng)節(jié)的數(shù)量有關(guān)，波幅越小，螺旋神經(jīng)節(jié)損失越多，是螺旋神經(jīng)節(jié)退化的標(biāo)志[25]。報道稱90-100歲的人類螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)量下降約30%[33]。高齡比低齡的ABR波幅小[22,24,26,27]，這與螺旋神經(jīng)節(jié)隨年齡增大而退化相符合，其中波I波幅與年齡關(guān)系更密切[22,24]。嚙齒類動物的研究發(fā)現(xiàn)耳蝸突觸數(shù)量與ABR波I波幅正相關(guān)[2,19,26,27]。也有多位學(xué)者報道ABR各波波幅與刺激聲強相關(guān)[2,18,24,28,29]，波I、III、V波幅與刺激聲強正相關(guān)[28,29];波I、II、IV、V與刺激聲強呈負相關(guān)，波III與刺激聲強呈正相關(guān)[29]。并可能與噪聲環(huán)境下的言語識別率下降[15,25]、反應(yīng)閾升高[2,21-23]有關(guān)。

目前ABR的波幅測量主要有兩種方法[7]：一種是量取波峰與波谷之間的差值(peak-to-tough或peak-to-peak)[1-3,15-25]，一種是波峰與基線的差值(peak-to-baseline)[10-13,32]。本文通過使用Blang-Altman法分析聽力正常豚鼠在最高刺激強度（90dB SPL）下的不同刺激頻率下波I、波III、波V、波I/V兩種波幅測量得到的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種測量方法得到的結(jié)果不一致。這提示在臨床上以I波幅度作為診斷指標(biāo)時，幅度測量方法可能會影響結(jié)果，或者影響判定界值。具體到兩種測量方法的優(yōu)劣，從ABR動作電位產(chǎn)生的電生理機制角度來看，自波的起始點至波谷的幅度差，能體現(xiàn)一個動作電位的完整過程，但波的起始點作為基線非常不穩(wěn)，影響因素多，且波谷也易受到很多因素的影響，因此雖然符合電生理機制，但在工作中存在很多不確定性，且記錄者的主觀影響大。本文中的兩種ABR波幅測量方法，從統(tǒng)計學(xué)分析的角度來看，測量方法2，即波峰-基線測量方法在聽力正常豚鼠中得到的I波幅度變異度（標(biāo)準(zhǔn)差）更小，也就是所得結(jié)果更穩(wěn)定；值得注意的是，本文的基線是從施加刺激信號的時間（0 ms）開始，平行于時間軸，比波的起點作為基線更穩(wěn)定，也更容易統(tǒng)一。這對未來建立I波幅度相關(guān)指標(biāo)的正常參考值以及臨床應(yīng)用給出了一定提示，即使用波峰-基線幅度差的測量方法確定I波以及其他波形幅度可以得到更為穩(wěn)定的結(jié)果。這一穩(wěn)定性對于后續(xù)建立正常參考值至關(guān)重要。本文是對I波幅度的測量方法在實驗動物上進行了初步探索，后續(xù)還需進行進一步工作，以期為建立穩(wěn)定的正常參考值提供方法依據(jù)。

另外有文獻指出通過波I/V幅度比更能反映突觸數(shù)量[11]及聽神經(jīng)活性[12]，且性別對其無明顯影響[10]，建議比較波I/V幅度比[1,9-12]，但考慮到V波的起源較I波復(fù)雜，且經(jīng)過了雙側(cè)聽覺交叉，會有諸多因素影響波V波幅，比如是否存在蝸后病變等，對于波幅比在隱性聽力損失診斷中的使用也需要更明確的依據(jù)。本文通過變異系數(shù)初步分析了波I幅度與波I/V幅度比這兩個指標(biāo)的離散程度，得出的結(jié)果顯示，無論采用峰-峰幅度測量法還是峰-基線幅度測量法，波I幅度均比波I/V幅度比的變異度小，波I/V幅度比的離散度較大。當(dāng)然，在本文所使用的實驗動物中，波III較波V的幅度更大，因此在閾值測試中常使用波III作為觀察指標(biāo)。但考慮到ABR的幅度在臨床上的應(yīng)用，本文還是針對I波和V波的幅度比進行了分析。后續(xù)工作還需在臨床得到的結(jié)果中進行驗證。