甜葉菊總黃酮提取條件、成分與抗氧化活性研究

童紅梅，宋巧，王保平，郭敏，彭濤，張敏

（甘肅醫(yī)學(xué)院，甘肅平?jīng)?744000）

0 引言

甜葉菊（Stevia rebaudiana）別名甜菊、糖草，屬菊科（Compositae），斯臺(tái)維亞屬，原產(chǎn)南美亞熱帶地區(qū)。全株都有甜味，其甜度是蔗糖的200～300倍，熱值僅為蔗糖1/300，是一種可替代蔗糖的天然甜味劑[1]。此外，甜葉菊莖葉中還含有大量蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、灰分、無(wú)氮浸出物和生物活性成分，因此，它可作為多種產(chǎn)品綜合開發(fā)利用的資源[2]。許多資料報(bào)道，甜葉菊有一定的藥理作用，有控制血糖，降低血壓，促進(jìn)新陳代謝的作用，亦有治療糖尿病，肥胖癥、調(diào)節(jié)胃酸和恢復(fù)神經(jīng)疲勞之功效[3]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員在甜葉菊中發(fā)現(xiàn)了一些黃酮成分，這些黃酮具有防治心血管疾病、降糖、降脂、鎮(zhèn)靜消炎、抗菌殺蟲、抗氧化延緩衰老、防癌抗腫瘤等作用，并可作為保健功能因子添加到食品、日化以及醫(yī)藥制品中[4-5]。但對(duì)甜葉菊的研究主要集中在甜菊糖苷的提取、研究和應(yīng)用方面，而對(duì)其黃酮類物質(zhì)的提取條件、成分檢測(cè)與抗氧化活性的方法研究報(bào)道不多[6-9]。

本研究為了探究甜葉菊莖葉中總黃酮含量與其抗氧化活性之間的關(guān)系，以甘肅酒泉產(chǎn)的甜葉菊為原料，通過(guò)對(duì)其總黃酮從提取條件、成分、抗氧化活性的相關(guān)性等方面進(jìn)行分析研究，以期為甜葉菊黃酮類保健產(chǎn)品的開發(fā)研制提供基礎(chǔ)性研究資料。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

甜葉菊選購(gòu)于酒泉市肅州區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，品種為惠農(nóng)1號(hào)，特請(qǐng)肅州區(qū)農(nóng)業(yè)局農(nóng)技科人員進(jìn)行了鑒定。冷藏于0℃的冰箱中備用。

1.1.2 試劑、儀器

（1）試劑：圣草枸杞苷、蘆丁、山奈素、槲皮素、橙皮苷和Trolox的標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）。DPPH、TPTZ購(gòu)自Wako化學(xué)試劑公司（美國(guó)），HPLC洗脫的甲醇為色譜純（加拿大）。其他試劑均為分析純。

（2）儀器：Agilent高效液相色譜儀-1290LC（美國(guó)），色譜柱 ODSC18 柱（4.6 mm×250 mm），中藥超聲提取機(jī)（JBT/C—YCL500T/3P，山東金百特），Heidolp旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)），微孔過(guò)濾器（天津雙吉實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)營(yíng)部），752E分光光度計(jì)（天津）。

1.2 甜葉菊莖葉中黃酮類物質(zhì)提取條件的優(yōu)化

1.2.1 樣品提取

取冷凍樣品3 g，液氮中充分研磨后按照料液比加入80%乙醇。在室溫下用中藥超聲提取機(jī)提?。ū?），提取液過(guò)濾后經(jīng)Heidolp旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)）減壓蒸干，最后用1mL甲醇定容轉(zhuǎn)移至1.5mL的Eppendorf管中離心去掉沉淀，用針頭式微孔過(guò)濾器 （有機(jī)系，孔徑0.30μm）過(guò)濾，接取少量濾液以備HPLC分析和抗氧化活性檢測(cè)，重復(fù)3次[10]。

表1 甜葉菊黃酮提取方法正交因子Table 1 Orthogonal factors for flavonoids extraction from stevia

1.2.2 正交試驗(yàn)

按L1644進(jìn)行正交試驗(yàn)。以蘆丁提取率為指標(biāo)，確定甜葉菊中黃酮提取最佳條件，并對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.3 甜葉菊莖葉中總黃酮含量旳測(cè)定

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，以25 mL甲醇為溶劑，溶解于容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得到濃度為0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和甜葉菊莖葉中總黃酮樣液以甲醇為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)358 nm測(cè)定吸光度[11]。

準(zhǔn)確吸取0.4、0.8、1.2、1.6mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于10mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，以甲醇作空白，在358 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，其線性回歸方程為y=30.064x+0.0029（R2=0.9998，y為吸光值，x為總黃酮質(zhì)量濃度mg/mL）。結(jié)果表明，在蘆丁質(zhì)量濃度0.005～0.020mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.2 甜葉菊莖葉中總黃酮的提取和得率

稱取甜葉菊渣在一定的條件下提取后，合并濾液并真空濃縮，干燥得粗總黃酮浸膏。取2～3 g粗黃酮浸膏，置于25mL容量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至刻度線[7]。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮得率。

（1）式中m1為黃酮浸膏的質(zhì)量；m2為原料質(zhì)量；X為浸膏得率；（2）式中C為樣品黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）,V為樣品的體積/25mL；m3為測(cè)得率時(shí)稱取的粗黃酮浸膏質(zhì)量；Y為總黃酮得率。

1.4 HPLC法測(cè)定甜葉菊中黃酮組分含量

HPLC分析條件為：以0.075mmol檸檬酸緩沖液（含0.025mmol乙酸銨，溶液A）和甲醇（溶液B）為流動(dòng)相，采用甲醇梯度洗脫，洗脫梯度為：0～3min，溶液B≤35%；然后保持35%溶液B不變，洗脫7 min；10～13 min，溶液 B 35%～50%，保持 3min；14～24min，溶液 B 50%～80%，保持 10 min；25～30 min 保持 100%溶液 A 7 min后結(jié)束一個(gè)循環(huán)，檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL。按照HPLC保留時(shí)間進(jìn)行樣品定性，峰面積積分法進(jìn)行樣品定量。

1.5 抗氧化活性分析

1.5.1 FRAP法

取100.0μL提取液與900.0μL Fe+-TPTZ反應(yīng)液（包括0.3 mmol/L醋酸鹽緩沖液25.0 mL；10.0 mmol/L TPTZ溶液2.5mL；20.0mmol/L FeCl3溶液2.5mL混勻，反應(yīng)10min，以80%乙醇為對(duì)照，Trolox為標(biāo)準(zhǔn)，用分光光度計(jì)測(cè)定595 nm處的吸光值，計(jì)算抗氧化活性，以μg/g DW為單位[7]。重復(fù)3次。

1.5.2 DPPH法

取100.0μL提取液與 3.9 mL DPPH（60.0μmol/L）混勻，反應(yīng)6 h，以 VC為對(duì)照，以 Trolox當(dāng)量（TEAC）為標(biāo)準(zhǔn)，用分光光度計(jì)測(cè)定515 nm處的吸光值，計(jì)算抗氧化活性（DPPH·清除率）[12]，重復(fù)3次。

DPPH·清除率=（A0-A1）×100/A1（A0代表空白，A1代表樣品檢測(cè)值）

2 結(jié)果與分析

2.1 甜葉菊黃酮提取條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表2、3結(jié)果進(jìn)行直觀分析可知：1）RD＞RB＞RC＞RA，影響甜葉菊黃酮物質(zhì)提取的主次因素為提取功率＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比；2）從各因素水平對(duì)甜葉菊黃酮物質(zhì)提取的影響來(lái)看，提取功率因素K1D＜K2D＜K3D＜K4D,說(shuō)明提取功率450W對(duì)黃酮提取影響最大；在提取溫度這個(gè)因素中，K2B＜K1B＜K3B＜K4B，說(shuō)明高溫85℃提取率高；在提取時(shí)間因素中 K1C＜K3C＜K2C＜K4C，說(shuō)明提取時(shí)間 150 min 最好；在料液比因素中，K4A＜K1A＜K3A＜K2A，料液比以1∶20為最好；3）由K值可知最佳工藝組合為A2B4C4D4。

表2 甜葉菊莖葉總黃酮提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal test results and analysis of extraction conditions of total flavonoids from stems and leaves of stevia

2.2 重復(fù)實(shí)驗(yàn)

用A2B4C4D4組合的工藝進(jìn)行了3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，其蘆丁提取得率為0.863、0.874和0.885μg/g DW，均值為0.874μg/gDW，總黃酮提取率最高可達(dá)到0.88%。高于處理中的次高組合A3B3C2D4，低于處理中的最高組合A2B4C4D4，進(jìn)一步驗(yàn)證了最佳組合為A2B4C4D4。

表3 甜葉菊莖葉總黃酮提取條件正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis of extraction conditions of total flavonoids from stem s and leaves of stevia

2.3 甜葉菊總黃酮類成分的檢測(cè)

用HPLC法，以檸檬酸-乙酸銨緩沖液和甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)了圣草枸杞苷、蘆丁、山奈素、槲皮素和橙皮苷類黃酮組分的標(biāo)準(zhǔn)品。該檢測(cè)體系分離效果好、精密度高，對(duì)類黃酮物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限（S/N=3）均低于0.05μg/g。利用該體系本研究有效檢測(cè)了甜葉菊莖葉中黃酮的含量。利用峰面積累計(jì)積分法計(jì)算得到甜葉菊莖葉中圣草枸杞苷的含量為57.44μg/g，蘆丁的的含量為701.42μg/g，山奈素的含量為241.21 μg/g，槲皮素的含量為451.55μg/g，橙皮苷的含量為297.54μg/g。以蘆丁的含量為最高，槲皮素的含量其次，山奈素與橙皮苷含量較少，圣草枸杞苷極微。

2.4 甜葉菊抗氧化活性與總黃酮類成分相關(guān)性分析

以FRAP和DPPH法檢測(cè)甜葉菊總黃酮的含量與抗氧化活性的相關(guān)性，分光光度法檢測(cè)其抗氧化活性高達(dá)10.02mg/g DW；用甜葉菊中黃酮的總量為橫坐標(biāo)，以抗氧化活性為縱坐標(biāo)，用抗壞血酸做對(duì)照，結(jié)果顯示，二者呈顯著的正相關(guān)性。說(shuō)明甜葉菊中黃酮類物質(zhì)抗氧化活性隨著黃酮含量的增加而增強(qiáng)，見表4。

表4 甜葉菊抗氧化活性與黃酮類含量相關(guān)性分析Table 4 Correlation between antioxidant activity and flavonoids content in stevia

3 結(jié)論與討論

3.1 甜葉菊總黃酮類物質(zhì)提取的條件

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：影響甜葉菊中黃酮物質(zhì)提取的主次因素為提取功率、提取溫度、提取時(shí)間、料液比；最佳提取條件為用80%乙醇提取功率450W，料液比1∶20，提取時(shí)間150min，溫度85℃，提取3次，依據(jù)總黃酮得率計(jì)算得到甜葉菊莖葉中黃酮提取率可達(dá)到0.88%。該結(jié)果與王紅玉報(bào)道甜葉菊中黃酮的得率（4.21%）低[8]，比方浩斌所測(cè)得率（0.62%）高[9]。這可能與甜葉菊的品種、產(chǎn)地、提取條件不同有關(guān)。提取條件的優(yōu)選可為甘肅酒泉甜葉菊黃酮類保健品的開發(fā)研究提供基礎(chǔ)資料。

3.2 甜葉菊總黃酮類物質(zhì)的成分

HPLC法檢測(cè)甜葉菊莖葉中5種黃酮成分，以蘆丁的含量（701.42μg/g）為最高，槲皮素含量（451.55μg/g）居其次，橙皮苷含量（297.54 μg/g）與山奈素含量（241.21 μg/g）較少，圣草枸杞苷含量（57.44 μg/g）極微。甜葉菊作為一種重要的糖料作物，在我國(guó)已經(jīng)有了大面積種植，甘肅酒泉肅州區(qū)氣候干燥、光照充足、晝夜溫差大，積溫高，十分有利于甜葉菊的生長(zhǎng)，其甜菊糖苷、總黃酮的含量較高。其栽培條件、生長(zhǎng)環(huán)境、品種特性對(duì)甜葉菊總黃酮含量和成分的相關(guān)性[13]，有待進(jìn)一步的探索研究。

3.3 甜葉菊總黃酮類抗氧化活性與含量相關(guān)性分析

利用FRPD和DPPH法評(píng)價(jià)甜葉菊莖葉總黃酮類抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)甜葉菊中總黃酮類物質(zhì)抗氧化活性高達(dá)10.02mg/g DW；綜合兩種評(píng)價(jià)方法其黃酮含量與抗氧化活性二者之間呈顯著的正相關(guān)性 （R=0.769～0.792）。在此基礎(chǔ)上，今后研究的重點(diǎn)是開展甜葉菊黃酮的生理功能分子機(jī)理探討，進(jìn)一步闡明甜葉菊黃酮成分的藥理作用，將是甜葉菊黃酮物質(zhì)研究與綜合開發(fā)利用的主要方向[14]。近年來(lái)，提取甜葉菊糖苷產(chǎn)生了大量的甜葉菊廢渣，利用廢棄甜葉菊渣提取黃酮類物質(zhì)的研究，既是甜葉菊產(chǎn)業(yè)鏈延伸的有效途徑，又是開發(fā)天然、無(wú)毒、無(wú)副作用植物性功能食品、保健藥品的有益探索，具有廣闊的開發(fā)前景。