復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)豬血紅蛋白和豬瘟抗體的影響

劉平祥， 梁鵬帥， 程龍梅， 劉金萍*， 陳嫦青， 莫宇麗， 陸應(yīng)誠(chéng)

（1.廣東驅(qū)動(dòng)力生物科技股份有限公司，廣東廣州 510560；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642）

豬瘟俗稱“爛腸瘟”，是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、發(fā)熱、接觸性傳染病，具有高度傳染性和致死性。目前已經(jīng)有多種豬瘟病毒疫苗被研制出來，而且在實(shí)際應(yīng)用中也取得了比較理想的效果，但在很多豬場(chǎng)部分豬群也出現(xiàn)了免疫失敗的情況，說明增進(jìn)豬群豬瘟抗性的研究仍需持續(xù)開展。近年來，血紅蛋白直接抑制病毒的分子機(jī)制被揭示，血紅蛋白β亞基與細(xì)胞RIG-I相互作用可激活RIG-I信號(hào)通路，從而上調(diào)IFN-β的表達(dá)，進(jìn)而抑制豬瘟病毒的增殖（如圖 1）（Dan 等，2013）。

圖1 HB抑制CSFV增殖和復(fù)制的分子機(jī)制

研究表明，復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑可以提升動(dòng)物造血功能，提高動(dòng)物的血紅蛋白濃度。本文通過研究血紅蛋白與豬瘟抗體水平關(guān)系及復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)豬瘟抗體水平的影響，以期為實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)豬瘟的抑制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑由廣州三行生物科技有限公司提供，其主要成分為1%菠菜提取物，100 mg/kg VB12等。

1.2 試驗(yàn)一：豬瘟病毒抗體水平與血紅蛋白濃度的關(guān)系

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于廣東省選取了3個(gè)豬場(chǎng)（HY豬場(chǎng)、SF豬場(chǎng)、SJ農(nóng)莊），分別隨機(jī)挑選不同階段的豬（表1）進(jìn)行豬瘟抗體水平及相應(yīng)血紅蛋白濃度的檢測(cè)。

1.2.2 豬瘟病毒抗體檢測(cè) 采用IEDXX豬瘟ELISA抗體試劑盒，按照試劑盒推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)及數(shù)據(jù)計(jì)算。

a．計(jì)算公式：

對(duì)照：

式中：NCx為陰性對(duì)照抗體滴度值；NC1A（450）為第一個(gè)陰性對(duì)照在450 nm波長(zhǎng)吸光度值；NC2A（450）為第二個(gè)陰性對(duì)照在450 nm波長(zhǎng)吸光度值。

表1 3個(gè)豬場(chǎng)豬群選取情況

b．判定標(biāo)準(zhǔn)：

陰性：阻斷率≤30%，可疑：30%＜阻斷率＜40%，陽(yáng)性：阻斷率≥40%。

1.3 試驗(yàn)二：復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)不同階段豬血紅蛋白濃度的影響

1.3.1 復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)母豬及所產(chǎn)仔豬血紅蛋白濃度的影響

1.3.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)于海南某大型豬場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期為母豬產(chǎn)前30 d至分娩。試驗(yàn)選取體況、胎次相近的母豬600頭，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組各300頭母豬，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加500 g/t的復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧參照NRC（1998）妊娠母豬營(yíng)養(yǎng)推薦需要量配制，具體見表2。試驗(yàn)期間母豬飼養(yǎng)管理按照豬場(chǎng)正常程序進(jìn)行，每日兩餐，自由飲水。

式中：PCx為陽(yáng)性對(duì)照抗體滴度值；PC1A（450）為第一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照在450 nm波長(zhǎng)吸光度值；PC2A（450）為第二個(gè)陽(yáng)性對(duì)照在450 nm波長(zhǎng)吸光度值。

試驗(yàn)有效性判定：

NCx>0.005 PCx阻斷率>50%。

樣品：

表2 母豬的基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3.1.2 血紅蛋白濃度測(cè)定 采用優(yōu)利特URIT-15血紅蛋白分析儀進(jìn)行檢測(cè)。母豬血紅蛋白濃度測(cè)定：每組各隨機(jī)挑選80頭母豬，于產(chǎn)前3 d檢測(cè)每頭母豬耳緣靜脈血紅蛋白濃度。初生仔豬血紅蛋白濃度測(cè)定：每組各隨機(jī)挑選80頭母豬檢測(cè)其初生仔豬1日齡（打鐵針前）耳緣靜脈血紅蛋白濃度，每窩隨機(jī)挑選2頭仔豬。

1.3.2 復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)保育豬血紅蛋白濃度的影響

1.3.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)于福建XH豬場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期36 d。選取健康、體重相近的30日齡仔豬160頭，隨機(jī)分成兩組，對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20頭保育豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加400 g/t的復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表3。試驗(yàn)期間保育豬飼養(yǎng)管理按照豬場(chǎng)正常程序進(jìn)行，每天定時(shí)喂料，自由飲水。

1.3.2.2 保育豬血紅蛋白濃度測(cè)定 采用優(yōu)利特URIT-15血紅蛋白分析儀進(jìn)行檢測(cè)。于試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選10頭保育豬，檢測(cè)其耳緣靜脈血紅蛋白濃度。

1.4 試驗(yàn)三：復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)豬瘟抗體水平的影響

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)地點(diǎn)為浙江某豬場(chǎng)，試驗(yàn)期39 d。試驗(yàn)選取健康、體重相近的30日齡保育豬320頭，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組與試驗(yàn)組，每組各8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20頭保育豬。試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加500 g/t復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑，一直飼喂至檢測(cè)豬瘟抗體水平結(jié)束；對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧?；A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表4。豬群于試驗(yàn)結(jié)束前24 d進(jìn)行豬瘟疫苗免疫，并于試驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行豬瘟抗體滴度檢測(cè)。試驗(yàn)期間保育豬飼養(yǎng)管理按照豬場(chǎng)正常程序進(jìn)行，每天定時(shí)喂料，飲水自由。

表3 保育豬基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

表4 保育豬基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4.2 豬瘟病毒抗體檢測(cè) 采用北京金諾百特科技有限公司豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)及數(shù)據(jù)計(jì)算。

a．試驗(yàn)有效性判定：陰性對(duì)照 OD值＞0.5；陽(yáng)性對(duì)照OD值＜0.5。

b．計(jì)算方法：

計(jì)算待檢樣品豬瘟病毒抗體的陽(yáng)性對(duì)照抗體滴度值（PC）：

c．判定標(biāo)準(zhǔn)：

樣品PC＜40%，判為陰性；樣品PC≥40%，判為陽(yáng)性；如果結(jié)果可疑，檢查樣品有無污染或者重檢；如果重檢結(jié)果依然可疑，應(yīng)結(jié)合豬場(chǎng)流行病學(xué)情況，重新采樣并檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，采用鄧肯法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 試驗(yàn)一：豬瘟病毒抗體水平與血紅蛋白濃度的關(guān)系 由圖2、3、4可知，豬瘟抗體水平與血紅蛋白濃度均有正相關(guān)趨勢(shì)。

2.2 試驗(yàn)二：復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)母豬及所產(chǎn)仔豬血紅蛋白濃度的影響 由表5可知，通過給母豬飼喂一個(gè)月復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑，試驗(yàn)組母豬血紅蛋白濃度相對(duì)對(duì)照組提高26.27%，且差異顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)組仔豬血紅蛋白濃度相對(duì)對(duì)照組提高18.84%，且差異顯著（P＜0.05）。說明通過給母豬飼喂復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑可以提高母豬及所產(chǎn)仔豬血紅蛋白濃度。

表5 復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)母豬及所產(chǎn)仔豬血紅蛋白濃度影響g/L

由表6可知，通過給保育豬飼喂一個(gè)月復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑，試驗(yàn)組保育豬血紅蛋白濃度相對(duì)對(duì)照組提高9.60%，且差異顯著 （P＜0.05）。說明通過給保育豬飼喂復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑可以提高其血紅蛋白濃度。

表6 復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)保育豬血紅蛋白濃度的影響g/L

2.3 試驗(yàn)三：復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)豬瘟抗體水平的影響 如表7所示，試驗(yàn)組豬瘟抗體水平高于對(duì)照組，是對(duì)照組的1.5倍（P＜0.05），且標(biāo)準(zhǔn)誤比對(duì)照組小，說明復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑可以提高豬瘟抗體水平，且均勻度較好。

表7 復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑對(duì)豬瘟抗體水平的影響

3 討論

血紅蛋白是最重要的酸堿緩沖物質(zhì)，紅細(xì)胞中的血紅蛋白及其鉀鹽是重要的維持機(jī)體體液平衡的緩沖物質(zhì)，對(duì)維持機(jī)體健康有重要作用 （劉佳，2010），其可增強(qiáng)動(dòng)物抗應(yīng)激及疾病抵抗力；紅細(xì)胞也是免疫細(xì)胞，是機(jī)體抗病的重要力量。紅細(xì)胞具有“免疫黏附作用”，細(xì)菌、病毒遇到紅細(xì)胞比遇到白細(xì)胞的機(jī)會(huì)多500~1000倍，紅細(xì)胞可以吸附病菌，然后將其遞呈給白細(xì)胞，將白細(xì)胞的吞噬能力提高4~5倍，另外，紅細(xì)胞表面的溶酶體酶可直接吞噬病菌 （郭峰，1995）；血紅蛋白濃度低，即貧血，會(huì)影響到機(jī)體的免疫反應(yīng)，特別是對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響尤為顯著（P＜0.01）（姚金水等，2013）。這可能是因?yàn)樨氀獣?huì)影響抗體制造及抗原抗體反應(yīng)，因?yàn)槎呓孕枰m宜的溫度及pH，而貧血對(duì)二者皆有影響（劉佳，2010；王黎生，2004；徐令和廖清奎，1990）。本研究結(jié)果表明，豬瘟抗體水平與血紅蛋白濃度呈正相關(guān)，與以上理論相一致。

菠菜提取物中的卟啉為血紅素的重要結(jié)構(gòu)，其也被用作生產(chǎn)補(bǔ)血造血的產(chǎn)品，而維生素B12的主要生理功能是參與制造骨髓紅細(xì)胞，防止惡性貧血（周晉等，2004）。本試驗(yàn)結(jié)果中復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑可以提高豬血紅蛋白濃度，與以上結(jié)論一致。同時(shí)該試驗(yàn)結(jié)果也表明復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑可以提高豬的豬瘟抗體滴度。

血紅蛋白能通過抑制豬瘟病毒的增殖（Dan等，2013），提高機(jī)體抵抗力并增加豬瘟抗體滴度，從而增加豬群對(duì)豬瘟的抵御力。提高血紅蛋白濃度將有利于對(duì)豬瘟的抵抗作用，據(jù)調(diào)查表明，20%的仔豬血紅蛋白濃度低于90 g/L，嚴(yán)重貧血；75%的豬場(chǎng)血紅蛋白濃度低于110 g/L，處于貧血狀態(tài)（Anne，2014）。對(duì)國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)進(jìn)行大量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)貧血現(xiàn)象更為普遍，有96%的母豬血紅蛋白濃度低于110 g/L，29.5%的母豬血紅蛋白濃度低于90 g/L（數(shù)據(jù)待發(fā)表）。因此，提高豬群的抗豬瘟能力，必須先減少豬群的貧血現(xiàn)狀。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，豬瘟抗體水平與血紅蛋白濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)，而復(fù)方菠菜提取物、VB12合劑可以提高豬血紅蛋白水平，從而提高豬瘟抗體水平。