單味與復(fù)方中草藥提取物抑制鐮刀菌的比較研究

關(guān)文超， 崔小珍， 楊 裕， 張 凱， 宋獻(xiàn)藝

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料獸藥研究所，山西太原 030031）

本研究針對(duì)多年來飼料及原料中玉米赤霉烯酮、雪腐鐮刀菌烯酮檢出率高，危害大的問題（龔阿瓊等，2015；王金勇等，2012），追溯到主要產(chǎn)毒菌鐮刀菌（Fusarium），選擇其中最具代表性的禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和串珠鐮刀菌（Fusarium verticillioides）為供試菌株 （敖志剛，2009；劉江，1996），研究中草藥提取物對(duì)其抑制效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試中草藥 購自太原某大藥房。

1.1.2 受試菌株 禾谷鐮刀菌（2697）、串珠鐮刀菌（2490）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂購于北京陸橋技術(shù)有限公司，馬鈴薯葡萄糖水購于廣東環(huán)海微生物科技有限公司，按照產(chǎn)品說明配置。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中草藥提取物制備 本試驗(yàn)采用水提法（丁振鐸，2012）。原料100 g，部分原料需提前破碎或浸泡，加水1000 mL，煎煮2~3 h，4層紗布過濾藥液；藥渣加水1000 mL，煮沸后煎煮2~3 h，過濾藥液；藥渣再加水1000 mL，煮沸后煎煮1 h，合并3次煎液，靜置12 h，濾取上清液文火濃縮，密度值為1.1~1.2，將藥液倒入滅菌罐中，60℃以下低溫噴霧干燥即得（關(guān)楓，2016）。所得提取物10~30 g。

1.2.2 菌種活化 禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌分別劃線接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，待斜面長滿霉菌后，按相同方法劃線接種到干凈的PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5~7 d，使其充分活化。

1.2.3 藥物培養(yǎng)基的配置 以一組藥物需要培養(yǎng)基60 mL計(jì)算。稱取提取物2.4 g，倒入無菌三角瓶，取15 mL無菌水稀釋制成均勻藥液，用移液管將培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基制備時(shí)僅添加推薦水量的75%）43 mL與藥液混合均勻注入平皿，制成藥物含量為4%的平板靜置備用。

1.2.4 抑菌活性測定 采用菌絲生長速率法。用直徑為5 mm的打孔器沿菌落邊緣取菌餅，分別移至含藥平板中央，有菌絲的一面朝下，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，28.5℃培養(yǎng)。生長40 h后，十字交叉法測量菌落直徑，記錄數(shù)據(jù)，10~12 d對(duì)照組霉菌長滿計(jì)算抑菌百分率（周永紅等，2001）。

2 結(jié)果

2.1 單味中草藥提取物抑制鐮刀菌篩選 由表1可知，單味提取物抑菌效果最優(yōu)為肉豆蔻，對(duì)串珠鐮刀菌抑制率為63.42%，同時(shí)對(duì)禾谷鐮刀菌也有良好的抑制作用。最終從26種中草藥中篩選出六味對(duì)兩種鐮刀菌均有抑菌作用的中草藥提取物，分別為肉豆蔻、黃芩、公丁香、訶子、石榴皮、五味子，其中五味子是在濾紙片篩選試驗(yàn)中顯現(xiàn)出較好的抑菌效果而選定的。試驗(yàn)中空白組沒有添加任何藥物，對(duì)照組防霉劑1、2為市場銷售的富馬酸二甲酯和山梨酸鉀，添加量為0.5‰和1‰（陳偉茹等，1998）。

2.2 兩味中草藥提取物配伍抑制鐮刀菌效果將篩選出的六味中草藥提取物按照1∶1的比例配伍組方，空白組沒有添加任何藥物，對(duì)照組防霉劑1、2、3是從規(guī)模飼料企業(yè)中隨機(jī)取樣的三種防霉劑，1為丙酸鈣；2為復(fù)合型防霉劑，主要成分為丙酸、甲酸；3為克霉寶，主要成分為丙酸鈉、二氧化硅。推薦用量分別為0.4‰、1.2‰、1‰，實(shí)際添加時(shí)均增加1倍。抑菌效果見表2。

供試濃度下，兩味藥物組方后，抑菌效果明顯提高，1-5，1-3，3-6，1-2，1-6 對(duì)串珠鐮刀菌的抑菌率超過55%，其中3種組方抑制率超過肉豆蔻單藥抑菌活性，1-5即肉豆蔻-石榴皮組抑菌率達(dá)到70.55%。對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌效果顯示，上述五組復(fù)方藥物的抑菌活性全部高于肉豆蔻單藥抑菌率，效果最優(yōu)組為1-6即肉豆蔻-五味子組。抑菌效果對(duì)比見圖1、圖2。

2.3 三味中草藥提取物配伍抑制鐮刀菌效果將篩選出的六味中草藥的提取物按照1∶1∶1的比例配伍組方。抑菌效果見表3。

表1 單味中草藥提取物對(duì)兩種鐮刀菌的抑菌效果

三味藥物配伍后，所有配伍對(duì)串珠鐮刀菌的抑制率均高于40%，其中10組復(fù)方藥物抑菌率達(dá)到50%以上；對(duì)禾谷鐮刀菌抑菌效果則更為顯著，抑菌率達(dá)到70%以上共7組，其中1-2-5即肉豆蔻-訶子-石榴皮組抑菌率最優(yōu)為77.91%，1-2-6即肉豆蔻-訶子-五味子組次之，抑菌率也超過77%。抑菌效果對(duì)比見圖3、圖4。

綜合以上數(shù)據(jù)，在供試濃度下，肉豆蔻-石榴皮兩藥配伍對(duì)串珠鐮刀菌抑菌作用最明顯；三藥組方對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用最強(qiáng)，肉豆蔻-訶子-石榴皮、肉豆蔻-訶子-五味子兩個(gè)組抑菌率超過77%。

表2 兩味中草藥配伍對(duì)鐮刀菌的抑菌效果

圖1 單味藥物與兩藥配伍抑制串珠鐮刀菌效果對(duì)比圖

圖2 單味藥物與兩藥配伍抑制禾谷鐮刀菌效果對(duì)比圖

表3 三味中草藥配伍對(duì)鐮刀菌的抑菌效果

圖3單味藥物與三藥配伍抑制串珠鐮刀菌效果對(duì)比圖

圖4 單味藥物與三藥配伍抑制禾谷鐮刀菌效果對(duì)比圖

3 討論

本試驗(yàn)中肉豆蔻、訶子、石榴皮、五味子在單藥抑菌和復(fù)方配伍中表現(xiàn)出了較好的的抑菌活性，其中肉豆蔻在六味組方藥物中是抑菌率最高和成功組方最多的藥物。

不同溶劑對(duì)不同植物的有效成分提取存在差異性（劉耀華，2015）。張海龍（2001）訶子化學(xué)成分提取試驗(yàn)表明，含有一定濃度鹽酸的乙醇提取物具有更強(qiáng)的抗真菌作用；蔡小華等（2018）研究表明，訶子水提物抑制真菌作用最強(qiáng)；熊素英（2007）石榴皮抑菌液的制備試驗(yàn)顯示，水、乙醇提取液具有抑菌活性，石油醚提取液沒有抑菌活性，供試菌株中抑菌活性細(xì)菌>霉菌>酵母菌；本試驗(yàn)中石見穿、貓爪草水提物對(duì)禾谷鐮刀菌沒有抑菌活性，而王樹桐 （2006）在禾谷鐮刀菌抑菌試驗(yàn)中選擇80%乙醇提取上述兩藥抑菌率均達(dá)到60%以上。本試驗(yàn)著重考慮水提物在飼料中添加的安全性和提取工作的便捷性，因此未針對(duì)不同藥物選擇不同的提取方法，一定程度上影響了部分藥物的抑菌活性，還需今后不斷完善。

中草藥復(fù)方不是單味藥物藥效的簡單累加，是體現(xiàn)性味歸經(jīng)、君臣佐使等配伍原則制成的一種特殊的化學(xué)藥物整體。張衛(wèi)紅（2000）和顧芯等（1995）在混合制劑抑菌作用試驗(yàn)和食品防腐劑中草藥復(fù)合劑的研制中均指出，中草藥提取物之間存在抗菌性的協(xié)同增效作用，混合使用可提高抗菌效果，不僅降低了抑菌濃度，而且抗菌范圍更為廣泛。本試驗(yàn)中，對(duì)禾谷鐮刀菌抑菌最優(yōu)配伍為1-2-5，而不是單藥抑菌率排名前三的組合，復(fù)方后較單藥最優(yōu)的肉豆蔻提高90%；對(duì)串珠鐮刀菌抑制率最高配伍為1-5而非1-2，復(fù)方較單藥最優(yōu)的肉豆蔻提高11%，說明五味子、石榴皮、訶子等藥物與肉豆蔻有協(xié)同作用，再一次證實(shí)中草藥復(fù)方后的協(xié)同增效作用。其次，本研究中三方提取物組方對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌作用最為明顯，肉豆蔻-訶子-五味子組和肉豆蔻-訶子-五味子組抑菌率達(dá)到77%（見圖5）。

圖5 肉豆蔻單藥和復(fù)方藥物抑制禾谷鐮刀菌效果對(duì)比圖

4 小結(jié)

本試驗(yàn)在水提條件下，肉豆蔻單藥抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌抑制率分別為63.42%、40.89%；按照等量組方后，肉豆蔻-石榴皮對(duì)串珠鐮刀菌抑制率達(dá)到70.55%，肉豆蔻-訶子-石榴皮、肉豆蔻-訶子-五味子對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率均超過77%，結(jié)果表明通過復(fù)方配伍可有效提高提取物對(duì)鐮刀菌的抑制作用。