納米蒙脫石對奶牛日糧中黃曲霉毒素B1的吸附效果研究

尚佳琪，周東年，王雅晶，劉 瀟，李勝利，盧 娜

（中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京市生鮮乳質(zhì)量安全工程技術研究中心，北京海淀100193）

黃曲霉毒素（AFs），主要是由曲霉屬中的黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）代謝產(chǎn)生的一類化學結構、致毒基團和理化性質(zhì)相似的毒性極強的次生代謝產(chǎn)物。目前已分離鑒定出的黃曲霉毒素有20余種，主要是黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2以及由 B1和 B2經(jīng)過羥化作用而衍生成的代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1和M2，且M1和M2主要存在于牛奶中 。這些常見的AFs中，毒性及致癌性最強的是AFB1，然后依次是AFM1、AFG1、AFB2和 AFG2。 其中，AFB1和 AFM1在1993年和2002年分別被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構劃分為I類致癌物（齊琪，2012；Bickers等，1994）。

霉菌毒素的污染問題日趨嚴重，若檢查處理措施不當，會造成嚴重的經(jīng)濟損失以及食品安全等問題。當奶牛食入污染AFB1的飼料時，會引起免疫系統(tǒng)失調(diào)紊亂，導致肝臟和腎臟的脂肪酸沉積，引發(fā)腦病和水腫病，以及真胃變位、子宮炎、乳房炎等疾病的發(fā)生。此外，AFB1會抑制蛋白質(zhì)的合成，使血清蛋白濃度發(fā)生變化，嚴重影響奶牛的體況和生產(chǎn)性能（黃祿華等，2013；陳波，2013；程廣龍等，2012；張治淮等，2012）。在霉菌毒素的防治上，預防是最簡單廉價的措施，需嚴格把握飼料原料的儲存和運輸過程中的環(huán)境條件以及對水分的控制。除預防之外，霉菌毒素吸附劑的使用也很有必要。霉菌吸附劑具有體外吸附和體內(nèi)抑制霉菌毒素的能力，是目前最常用的脫毒法。本試驗選取一種納米蒙脫石吸附劑，通過與黃曲霉毒素B1同時添加在奶牛日糧中，旨在研究納米蒙脫石吸附劑的吸附效果，降低毒素在牛奶中的殘留。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗所用納米蒙脫石吸附劑購自浙江某公司，產(chǎn)品為灰白色粉末。納米蒙脫石具有特殊的晶層結構，由于各晶層間的靜電不平衡使得層面具有電負性，對體積較小的黃曲霉毒素具有很大吸附力。

試驗所用黃曲霉毒素B1標準品購自廣州寶柏貿(mào)易有限公司，品牌為Enzo Life Sciences，產(chǎn)品純度高達98%以上。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理 選取產(chǎn)奶量 [（36.2±3.5）kg]、胎次[（1.8±0.5）胎]和泌乳天數(shù)[（140±15）d]相近的健康荷斯坦泌乳牛45頭，按每組15個重復隨機分為3組，每個重復1頭牛。對照組飼喂基礎日糧，試驗Ⅰ組在基礎日糧中添加0.1 mg/kg的黃曲霉毒素標準品，試驗Ⅱ組在基礎日糧中添加0.1 mg/kg的黃曲霉毒素標準品+3 g/kg的納米蒙脫石吸附劑 （于每日晨飼時在基礎日糧中添加樣品，攪拌均勻）。試驗在中國農(nóng)業(yè)大學順義基地進行，試驗牛在同一牛舍散欄飼養(yǎng)，每日分3次飼喂全混合日糧（TMR）（8：00、14：00、20：00），并保證5%的剩料量，自由飲水，每日于擠奶廳擠奶3次（7：00、13：00、19：00）。 試驗期間使用動物采食監(jiān)控系統(tǒng)（AIMS）監(jiān)控奶牛采食量。預試期7 d，正試期 14 d，共 21 d。

1.3 試驗日糧 試驗期間以牧場TMR為基礎日糧，日糧參照NRC（2001）配制。三組日糧除樣品添加不同，其他原料組成完全相同?；A日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

1.4 指標測定及方法

1.4.1 飼料樣品的采集與營養(yǎng)成分的測定 試驗期間每7 d采集一次基礎日糧和剩料，采集樣品用四分法進行收集，將所收集樣品置于65℃烘箱烘干48 h，回潮48 h后制成風干樣，粉碎后保存待測。根據(jù)張麗英（2016）所述方法對常規(guī)營養(yǎng)成分進行分析。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎）

1.4.2 干物質(zhì)采食量的測定 試驗期間利用AIMS系統(tǒng)記錄每日采食量與剩料量，計算干物質(zhì)采食量（DMI）。

1.4.3 產(chǎn)奶量、乳成分及牛奶中黃曲霉毒素M1的測定 試驗期間每天記錄每頭奶牛的產(chǎn)奶量。于正試期第0天、第7天、第14天按早中晚4∶3∶3混合均勻共100 mL采集奶樣，所得奶樣其中50 mL加入重鉻酸鉀防腐劑及時送至北京奶牛中心做乳成分測定，測定指標包括：乳蛋白率、乳脂率、乳糖率、體細胞數(shù)和乳固形物的含量。其余50 mL送至北京萊博泰瑞科技發(fā)展公司測定牛奶中黃曲霉毒素M1的含量。

1.4.4 血液指標的測定 于正試期第0天、第7天、第14天每組隨機挑選5頭牛，于晨飼前用真空采血管進行尾根采血10 mL。所采集血液置于4000 r/min離心機，10 min后，將所得血清分裝在1.5 mL離心管中-20℃保存待測。血樣送至北京萊博泰瑞科技發(fā)展公司測定，測定指標包括：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOP）、堿性磷酸酶（ALP）和黃曲霉毒素B1的含量。

1.4.5 黃曲霉毒素轉(zhuǎn)化率

轉(zhuǎn)化率/%=牛奶中黃曲霉毒素M1檢出量/日糧中黃曲霉毒素B1添加量×100。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)先使用Excel 2007進行初步整理，之后采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，Duncan氏多重比較法進行差異顯著性檢驗，顯著水平定為P＜0.05，結果以“平均值±標準差”表示。

表2 添加AFB1和吸附劑對奶牛生產(chǎn)性能和牛奶中AFM1含量的影響

2 結果與分析

2.1 DMI、產(chǎn)奶量、乳成分和牛奶中黃曲霉毒素M1含量 如表2所示，試驗Ⅰ組的產(chǎn)奶量分別較對照組和試驗Ⅱ組降低0.64 kg/d和0.50 kg/d（P＜0.05）；試驗Ⅰ組的4%校正乳分別較對照組和試驗Ⅱ組降低1.01 kg/d和0.65 kg/d （P＜0.05）；試驗Ⅰ組牛奶中黃曲霉毒素M1分別較對照組和試驗Ⅱ組提高 1.57 μg/L 和 1.44 μg/L（P ＜ 0.05），試驗Ⅱ組稍高于對照組，但無顯著差異（P＞0.05）；三組之間DMI和各項乳成分均無顯著差異。

2.2 血清中酶活性和黃曲霉毒素B1含量 如表3所示，霉菌毒素的添加會很明顯的影響血清中相關酶的活性和AFB1的含量。除GPT活性在三組間無顯著差異外（P＞0.05），試驗Ⅰ組的GOT和ALP活性以及AFB1的含量分別較對照組和試驗Ⅱ組顯著提高了 8.86、5.31、1.23 U/L （P ＜0.05），8.64、4.25、1.20 U/L（P ＜ 0.05），其中，對照組和試驗Ⅱ組的各項指標均未產(chǎn)生顯著性差異（P ＞ 0.05）。

表3 添加AFB1和吸附劑對奶牛血清酶活性和AFB1含量的影響U/L

3 討論

3.1 DMI、產(chǎn)奶量、乳成分和牛奶中黃曲霉毒素M1含量 大量研究表明，奶牛日糧在被黃曲霉毒素污染時，會直接影響奶牛的生產(chǎn)性能。國內(nèi)外對于黃曲霉毒素和吸附劑應用的研究較多。Kutz等（2009）在泌乳中期奶牛日糧中添加黃曲霉毒素B1和吸附劑后發(fā)現(xiàn)，奶牛的產(chǎn)奶量、干物質(zhì)采食量以及乳成分都沒有發(fā)生顯著性的變化。Queiroz等（2012）在受到黃曲霉毒素污染的日糧中添加了不同劑量的吸附劑后得出結論，吸附劑的使用并沒有改變奶牛干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量。熊江林（2014）發(fā)現(xiàn)，不同添加水平的吸附劑并沒有顯著改善采食被污染日糧的奶牛生產(chǎn)性能。齊琪（2012）在研究中發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素B1對奶牛日糧的污染并沒有影響到奶牛的產(chǎn)奶量和乳脂、乳蛋白，但乳糖含量卻顯著上升。本研究中，吸附劑的使用對奶牛的干物質(zhì)采食量和乳成分沒有產(chǎn)生影響，但是顯著提高了奶牛的產(chǎn)奶量和4%校正乳產(chǎn)量。各研究得出結論不同的原因可能與黃曲霉毒素B1和吸附劑的添加量水平不同、吸附劑種類不同以及日糧組成差異等有關。

黃曲霉毒素在奶牛機體中代謝迅速，奶牛在采食被黃曲霉毒素B1污染的日糧后，黃曲霉毒素M115 min后就會出現(xiàn)在血液中，12 h后就會出現(xiàn)在牛奶中，24 h后可達到最大濃度 （Moschini等，2010）。當停止采食被污染日糧72 h后，牛奶中不再會檢測出黃曲霉毒素 M1（Masoero等，2007）。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，日糧中的黃曲霉毒素B1轉(zhuǎn)化為牛奶中的黃曲霉毒素M1存在線性規(guī)律，其轉(zhuǎn)化率為0.1%~6%（Coffey 等，2009），馬美蓉等（2014）表明，轉(zhuǎn)化率的平均理論值為1.7%。Kutz等（2009）在研究中得出，轉(zhuǎn)化率為1.42%~2.65%。本試驗中，黃曲霉毒素B1添加水平為100 μg/kg，牛奶中黃曲霉素M1檢出量為1.62 μg/L，轉(zhuǎn)化率為1.62%，與前人研究結果相似。在我國乳及乳制品黃曲霉毒素M1限量標準中規(guī)定，鮮奶中黃曲霉毒素M1的限量標準為 0.5 μg/kg（梁江等，2013），本試驗通過吸附劑的使用，使牛奶中的黃曲霉毒素M1從1.62 μg/L下降至 0.18 μg/L，低于國家標準限制（0.5 μg/L），說明此吸附劑對毒素吸附效果良好。

3.2 血清中酶活性和黃曲霉毒素B1含量 黃曲霉毒素B1對動物體肝臟危害最大，毒素在肝臟蓄積后容易引起肝癌。ALP、GOP和GPT三種酶是評估肝臟功能是否正常的重要指標，這三種酶的活性會由肝細胞的破損而增加。齊琪（2012）表明，日糧中添加20 μg/kg和40 μg/kg的黃曲霉毒素B1對反映肝臟功能的酶活性無顯著影響。熊江林（2014）在奶牛日糧中添加20 μg/kg黃曲霉毒素B1后得出相似結論。Helferich等（1986）在肉牛的日糧中添加600 μg/kg的黃曲霉毒素B1，結果顯示，無論是在飼喂毒素期間還是觀察期間，均觀察到肝臟的病變現(xiàn)象。在本試驗中，黃曲霉毒素B1的添加量為100 μg/kg，試驗結果顯示，GOT和ALP酶活性顯著上升，說明黃曲霉毒素B1會影響奶牛的肝臟功能。但是與前人研究結果相比，對反映肝臟功能的酶活性的影響卻不同。推測導致結果不同的原因可能是黃曲霉毒素B1的添加量不同，但是具體能影響到酶活性的添加量水平需要進一步考證。

黃曲霉毒素B1不僅會影響到動物的生產(chǎn)性能，毒素還會沉積在動物的肝臟、腎臟、血液以及肌肉中，影響機體健康。本試驗中，隨著黃曲霉毒素B1的添加，血清中黃曲霉毒素B1含量顯著上升，但是通過添加吸附劑后，毒素水平可降低至正常水平，進一步肯定了吸附劑對毒素的吸附作用。

4 結論

4.1 日糧中添加0.1 mg/kg黃曲霉毒素B1，奶牛的產(chǎn)奶量和4%校正乳顯著下降，牛奶中黃曲霉毒素M1含量顯著上升，血清中GOP和ALP活性顯著增強以及血清中黃曲霉毒素B1含量顯著上升。

4.2 在黃曲霉毒素B1污染的日糧中添加3 g/kg的納米蒙脫石吸附劑可有效緩解奶牛產(chǎn)奶量下降、有效吸附黃曲霉毒素B1，牛奶中黃曲霉毒素M1的含量符合國家最高限量標準。