乳酸菌對(duì)低溫下玉米秸稈黃貯發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響

謝華德，李苗苗， 靳思玉， 王立超， 曹 陽

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

玉米秸稈是子實(shí)收獲后留下的含纖維成分高、質(zhì)地比較粗硬的農(nóng)作物副產(chǎn)物。對(duì)玉米秸稈進(jìn)行青貯、黃貯、微貯等發(fā)酵處理可以軟化秸稈，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善適口性、并提高飼料轉(zhuǎn)化率，是一種有效開發(fā)利用秸稈資源的方式（劉海燕等，2016；孫文等，2010；刁其玉等，2005）。發(fā)酵飼料的質(zhì)量通常會(huì)受到原料種類、原料品質(zhì)、貯藏溫度、附生乳酸菌等因素的影響（Liu等，2011；Kim等，2006；Lin 等，1992；McDonald 等，1966）。其中，乳酸菌在制作發(fā)酵飼料時(shí)起著關(guān)鍵的作用（Hu等，2009；趙政等，2009）。在厭氧發(fā)酵的環(huán)境中，乳酸菌大量繁殖，從而將飼料中的淀粉和可溶性糖變成乳酸，降低pH，抑制丁酸菌、大腸桿菌及霉菌等有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而提高發(fā)酵飼料質(zhì)量（Cao等，2011；趙輝等，2010；Cai等，1999）。 然而，當(dāng)玉米收割期到來時(shí)，我國(guó)北方的氣溫下降，尤其東北地區(qū)急劇下降，平均氣溫達(dá)到4°C左右（郭志梅等，2005）；在低溫條件下發(fā)酵的飼料，乳酸菌的活性受到抑制，乳酸發(fā)酵很難充分進(jìn)行，難以達(dá)到調(diào)制高質(zhì)量發(fā)酵飼料的目的 （Liu等，2012；Cao等2011）。另外，當(dāng)開貯取料時(shí)，厭氧環(huán)境被破壞，發(fā)酵飼料接觸空氣后，細(xì)菌、酵母菌及霉菌等有害微生物活動(dòng)旺盛，出現(xiàn)好氣性腐敗，并產(chǎn)出大量的熱，飼料中的乳酸含量迅速下降，pH上升，氨態(tài)氮濃度增加，從而破壞發(fā)酵飼料在厭氧條件下的 穩(wěn) 定 性 （Liu 等 ，2013；McDonald 等 ，1991；Woolford，1990）。

本試驗(yàn)采用小規(guī)模發(fā)酵法，在低溫條件發(fā)酵的黃貯玉米秸稈中添加不同的乳酸菌，探究其對(duì)玉米秸稈黃貯的發(fā)酵品質(zhì)、微生物數(shù)量以及有氧穩(wěn)定性的影響，以期篩選出低溫下高效發(fā)酵乳酸菌，為低溫季節(jié)或低溫地區(qū)調(diào)制高品質(zhì)秸稈發(fā)酵飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 玉米秸稈取自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)試驗(yàn)田，然后將其鍘短至1~2 cm，水分調(diào)整為65%；乳酸菌由日本國(guó)立畜產(chǎn)基地研究所提供，分別是 LAB1（Chikuso-1）、LAB2（Master-LP）和LAB3（Master-AC）。

1.2 乳酸菌添加處理 試驗(yàn)處理包括一個(gè)對(duì)照組及乳酸菌 LAB1組、LAB2組、LAB3組、LAB1+LAB2組、LAB1+LAB3組和LAB2+LAB3組。采用小規(guī)模發(fā)酵法，稱取300 g備用的秸稈原料，裝入16 cm×25 cm的食品級(jí)聚乙烯袋內(nèi)，每個(gè)處理組4袋（共28袋），真空密封后，置于4°C條件下發(fā)酵。在30 d后，每種處理各開封3袋，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 發(fā)酵特性 開封后立即稱取黃貯發(fā)酵的飼料樣品20 g，加入180 mL滅菌水，用均質(zhì)器拍打90 s使其充分混勻，再進(jìn)行過濾。濾液用于測(cè)定飼料pH及有機(jī)酸。有機(jī)酸的測(cè)定：濾液經(jīng)2000 r/min離心5 min，用0.22 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜儀（色譜柱KC-811，檢測(cè)器SPD-M10AVP，柱溫 50°C，流速 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm，進(jìn)樣量 5 μL），檢測(cè)乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。

1.3.2 微生物組成及數(shù)量 稱取20 g玉米秸稈原料以及黃貯發(fā)酵后的飼料樣品于聚乙烯塑料袋內(nèi)加180 mL滅菌水，用均質(zhì)器拍打90 s使其充分混勻，在塑料袋內(nèi)取1 mL混合液，將其在滅菌的試管中依次按梯度稀釋成10-1、10-3、10-5倍液，用乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、大腸桿菌顯色鑒別培養(yǎng)基（BLB）、強(qiáng)化梭菌鑒定瓊脂（DRCA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，分別檢測(cè)乳酸菌、一般細(xì)菌和耐熱菌、大腸桿菌、丁酸菌、霉菌和酵母菌?；旌弦和坎嫉脚囵B(yǎng)基后，將大腸桿菌、酵母菌、霉菌、耐熱性菌（濾液在75°C水浴鍋中加熱15 min后涂板）置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，乳酸菌、丁酸菌置于30°C厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，分別計(jì)數(shù)（單位質(zhì)量新鮮樣品中微生物數(shù)量 lg cfu/g FM）（Cao等，2011）。

1.3.3 有氧穩(wěn)定性試驗(yàn) 在發(fā)酵30 d開封后，取各個(gè)袋發(fā)酵的樣品100 g，放入1000 mL無蓋的聚乙烯瓶中，敞口放置，通過檢測(cè)發(fā)酵飼料的溫度變化，考察其有氧氧化情況。即在室溫條件下，連續(xù)測(cè)試容器內(nèi)飼料的溫度，當(dāng)飼料溫度比室溫高于2 °C 時(shí)，被認(rèn)為發(fā)生有氧氧化（Nishino等，2004），并測(cè)定其pH、有機(jī)酸、NH3-N和微生物含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excel軟件整理基礎(chǔ)數(shù)據(jù)后，采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，并用Tukey法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米秸稈原料的化學(xué)成分及微生物含量由表1可看出，玉米秸稈原料的干物質(zhì)含量為91.28%，有機(jī)物、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、酸性洗滌纖維及中性洗滌纖維分別為干物質(zhì)含量的90.07%、5.18%、1.18%、44.86%及67.22%。同時(shí)，在玉米秸稈原料中檢測(cè)到乳酸菌及耐熱菌的數(shù)量達(dá)104，一般細(xì)菌、大腸桿菌及酵母菌的數(shù)量均達(dá)到107，原料中丁酸菌的數(shù)量為103。

表1 玉米秸稈原料的化學(xué)成分及微生物

2.2 乳酸菌對(duì)低溫條件下玉米秸稈黃貯發(fā)酵品質(zhì)的影響 由表2可以看出，試驗(yàn)LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的 pH 分別較對(duì)照組降低了 7.32%、8.44%、11.32%、6.95%、5.71%、8.82%（P<0.05）；其中，LAB3組的 pH 最低，為 4.65。 與對(duì)照組相比，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的乳酸含量分別高了 18.42%、23.68%、32.46%、28.07%、16.67%、26.32%（P<0.05）。 試驗(yàn) LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的乙酸含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），其中LAB3組的含量最高。各組間的丙酸含量均無顯著差異（P>0.05）。LAB1、LAB2、LAB3組的丁酸含量均高于對(duì)照組，但均無顯著差異 （P>0.05）。 試驗(yàn) LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的氨態(tài)氮濃度分別較對(duì)照組降低了 9.32%、14.20%、21.02%、10.34%、11.04%、14.20%（P<0.05）， 其中 LAB3組下降的幅度最大，為21.02%。

2.3 乳酸菌對(duì)低溫條件下玉米秸稈黃貯微生物數(shù)量變化的影響 由表3可以看出，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的乳酸菌數(shù)量均大于對(duì)照組，其中LAB3組最多，為7.91 lg cfu/g FM （P<0.05）。 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的一般細(xì)菌數(shù)量均少于對(duì)照組，其中LAB2+LAB3組最少，為6.18 lg cfu/g FM （P<0.05）。 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的大腸桿菌數(shù)量均少于對(duì)照組，其中，LAB3組最少，為3.14 lg cfu/g FM（P<0.05）。各組間的耐熱菌數(shù)量均無顯著差異。各組中均未檢測(cè)出丁酸菌和霉菌。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的酵母菌數(shù)量顯著小于對(duì)照組（P<0.05）。

2.4 乳酸菌對(duì)低溫條件下玉米秸稈黃貯有氧氧化后pH、有機(jī)酸及氨態(tài)氮含量的影響 由表4可知，在發(fā)生有氧氧化后，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的 pH 分別較對(duì)照組降低了 13.26%、7.62%、14.19%、9.67%、10.54%、10.54%（P<0.05），其中LAB3組的下降率最高，為14.19%。 LAB1、LAB2、LAB3組的乳酸含量均顯著高于對(duì)照組和 LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、組（P<0.05）。與對(duì)照組相比，LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3組的乙酸含量均顯著增多（P<0.05）。各組間的丙酸和丁酸含量均無顯著差異（P>0.05）。與對(duì)照組相比，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組 的氨態(tài)氮含量均顯著降低（P<0.05）。

2.5 乳酸菌對(duì)低溫條件下玉米秸稈黃貯有氧氧化后微生物數(shù)量變化的影響 由表5可知，在發(fā)生有氧氧化后，LAB2+LAB3組的乳酸菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組和 LAB2、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3組（P<0.05）； LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的一般細(xì)菌數(shù)量均小于對(duì)照組，其中 LAB1組顯著減少 （P<0.05）。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的大腸桿菌數(shù)量均小于對(duì)照組，其中LAB1+LAB2組最少，但無顯著差異 （P>0.05）。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的耐熱菌數(shù)量均小于對(duì)照組，其中LAB3、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的數(shù)量顯著降低 （P<0.05）。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的丁酸菌數(shù)量均小于對(duì)照組，其中LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組最少（P<0.05）。 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的霉菌數(shù)量均小于對(duì)照組，其中，LAB1組最少，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。

表2 低溫下玉米秸稈發(fā)酵30 d的發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定結(jié)果

表3 低溫下玉米秸稈發(fā)酵30 d的微生物數(shù)量檢測(cè)結(jié)果lg cfu/g FM

表4 玉米秸稈發(fā)酵30 d有氧氧化后的pH、有機(jī)酸及氨態(tài)氮含量的變化

3 討論

3.1 玉米秸稈原料的化學(xué)成分及微生物 發(fā)酵飼料成功的關(guān)鍵在于提供適宜的條件。為創(chuàng)造厭氧環(huán)境要把原料壓實(shí)，而水分含量過低，不易壓實(shí)，所以發(fā)酵飼料適宜的水分含量為65%~70%（Cao等，2009）。通過對(duì)玉米秸稈原料的化學(xué)成分檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干物質(zhì)含量為91.28%，因此，本試驗(yàn)通過調(diào)整水分含量為65%對(duì)玉米秸稈進(jìn)行發(fā)酵。與其他常用的大豆秸稈、谷草和甘蔗梢葉等發(fā)酵飼料原料相比，本試驗(yàn)中使用的玉米秸稈粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和中性洗滌纖維含量較低（吳兆鵬等，2016；閆艷紅等，2014；郭勇慶等，2009）。在玉米秸稈原料中檢測(cè)到乳酸菌及耐熱菌的數(shù)量達(dá)104，一般細(xì)菌、大腸桿菌及酵母菌的數(shù)量均達(dá)到107，丁酸菌的數(shù)量為103。主要可能與玉米秸稈原料放置時(shí)間過長(zhǎng)后導(dǎo)致水分、化學(xué)營(yíng)養(yǎng)成分和附著微生物的含量差異很大有關(guān)（Yahaya等，2002；Garcia等，1989）。

3.2 乳酸菌對(duì)低溫條件下玉米秸稈黃貯發(fā)酵品質(zhì)的影響 發(fā)酵飼料的pH可以反映飼料品質(zhì)受腐敗菌和霉菌影響的程度。玉米秸稈發(fā)酵過程中，pH下降的主要原因是乳酸菌大量繁殖產(chǎn)生乳酸促使發(fā)酵飼料酸度降低。王鵬等（2011）對(duì)低溫條件下混合乳酸菌制劑對(duì)蘆葦發(fā)酵品質(zhì)的影響研究發(fā)現(xiàn)，4°C條件下的pH始終穩(wěn)定在4.20以下，這與本試驗(yàn)的結(jié)果不一致，這可能是不同種類的乳酸菌活性受溫度限制的程度不同。有機(jī)酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）含量及其構(gòu)成比例是鑒別發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)。賈軍等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，接種低溫乳酸菌復(fù)合菌系可以明顯改善玉米秸稈與馬鈴薯渣混合發(fā)酵飼料的品質(zhì)。劉圈煒等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合乳酸菌制劑可改善玉米秸稈青貯品質(zhì)。王昆昆等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌制劑能降低青貯的pH，提高乳酸含量，改善青貯飼料的青貯品質(zhì)。Courtin等（1990）報(bào)道，乳酸是降低pH的主要有機(jī)酸，通常以乳酸在總酸中比例最高為好，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。氨態(tài)氮含量也是判定飼料品質(zhì)的主要指標(biāo)（劉建新等，1999）。本試驗(yàn)中，添加乳酸菌可以降低玉米秸稈黃貯飼料的氨態(tài)氮含量，表明添加乳酸菌使玉米秸稈附著的乳酸菌數(shù)量增多，發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的乳酸能減少早期植物蛋白酶對(duì)含氮化合物的降解作用，降低氨態(tài)氮/總氮含量，改善黃貯發(fā)酵飼料的品質(zhì)（姜義寶等，2017）。

3.3 乳酸菌對(duì)低溫條件下玉米秸稈黃貯微生物數(shù)量變化的影響 在發(fā)酵的好氣性細(xì)菌活動(dòng)階段過后，乳酸球菌大量繁殖，迅速降低pH，促使腐敗菌、丁酸菌等活動(dòng)受到抑制。本試驗(yàn)低溫環(huán)境雖然會(huì)降低乳酸菌發(fā)酵速度，但經(jīng)過30 d的發(fā)酵，乳酸菌總數(shù)也維持在6.59 lg cfu/g FM及更高水平。Cao等（2011）在研究乳酸菌對(duì)菜渣發(fā)酵品質(zhì)及瘤胃體外消化的影響中發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌能促進(jìn)乳酸菌的繁殖，降低pH，抑制好氧性細(xì)菌、大腸桿菌、丁酸菌、霉菌及酵母菌的生長(zhǎng)，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。未檢測(cè)到霉菌，證明玉米秸稈黃貯密封良好，未發(fā)生二次發(fā)酵，否則發(fā)酵飼料會(huì)產(chǎn)生霉變腐敗，溫度上升并附著霉菌。

表5 玉米秸稈發(fā)酵30 d有氧氧化后微生物數(shù)量測(cè)定結(jié)果lg cfu/g FM

3.4 乳酸菌對(duì)低溫條件下玉米秸稈黃貯有氧氧化后pH、有機(jī)酸及氨態(tài)氮含量的影響 當(dāng)發(fā)酵窖打開后，發(fā)酵飼料暴露于空氣中，好氧微生物分解乳酸和殘余的水溶性碳水化合物 （WSC）產(chǎn)生CO2，同時(shí)也會(huì)分解蛋白質(zhì)和氨基酸為氨或胺類物質(zhì)，導(dǎo)致pH升高，飼料消化率降低，適口性降低（Woolford，1990）。 McDonald 等（1991）研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料暴露在空氣中有機(jī)酸會(huì)明顯減少，這與本研究的結(jié)果一致。Filya等（2000）在乳酸菌制劑對(duì)小麥秸稈青貯的發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性影響中發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌菌劑可以顯著提高小麥秸稈青貯的發(fā)酵品質(zhì)，提高有氧穩(wěn)定性。張濤等（2007）將布氏桿菌、植物乳桿菌及兩者的復(fù)合菌劑加入苜蓿青貯中發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌菌劑可以顯著提高苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)，延長(zhǎng)有氧穩(wěn)定性的時(shí)間。在本試驗(yàn)中，在低溫條件下發(fā)酵的玉米秸稈黃貯飼料中添加乳酸菌均可提高發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定性。

3.5 乳酸菌對(duì)低溫條件下玉米秸稈黃貯有氧氧化后微生物數(shù)量變化的影響 許多研究表明，酵母菌的快速大量繁殖是破壞有氧穩(wěn)定性的主要原因之一 （Liu 等，2013；Wang 等，2008；McDonald 等，1991；Woolford 等，1990）。本試驗(yàn)中，酵母菌數(shù)量維持較高水平，可能是因?yàn)楫a(chǎn)生的乳酸可為乳酸同化型酵母菌等好氧微生物提供生長(zhǎng)繁殖所需要的底物（郭旭生等，2006）。本試驗(yàn)中，有氧氧化后大腸桿菌、丁酸菌和霉菌數(shù)量均顯著增多，表明飼料已經(jīng)發(fā)生腐敗霉變，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值減少，飼喂價(jià)值喪失。

4 結(jié)論

在低溫條件下，添加乳酸菌制劑可有效降低玉米秸稈黃貯飼料pH，增加乳酸菌數(shù)量，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，改善玉米秸稈黃貯品質(zhì)，同時(shí)提高玉米秸稈黃貯的有氧穩(wěn)定性,其中添加乳酸菌LAB3效果最好。