糞腸球菌R-WL發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

胡紅偉，麻嘯濤，閆凌鵬，陳茹茹，張嬋娟，楊京娥，李自茹，黨亞鵬，任 帥

（山西大禹生物工程股份有限公司，山西運城 044600）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是乳酸菌中的一類，屬于鏈球菌科腸球菌屬，是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性球菌，鏈狀排列，無芽孢，兼性厭氧（Ben 等，2018；Amachawadi等，2018）。 糞腸球菌是人和動物腸道的一類重要菌群，可參與機體多種代謝活動（Hwanhlem 等，2017；Ba 等，2017）。 糞腸球菌可產(chǎn)生多種腸球菌菌素，對機體健康具有重要意義，另外，在菌種生長代謝過程中產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙酸、過氧化氫和甘露聚糖肽等，乳酸和乙酸可使腸道pH下降，拮抗病原菌的生長繁殖，過氧化氫和甘露聚糖肽等可殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌 （Allameh等，2017；Li等，2017；Chen 等，2017；Song 等，2016）。 糞腸球菌作為益生菌已經(jīng)在醫(yī)學(xué)和飼料領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用（Liu 等，2017；Zeng 等，2016；Perumal等，2016）。

制備糞腸球菌高濃菌粉，需要使糞腸球菌菌體密度最大，但是糞腸球菌存在抗逆性差和培養(yǎng)后期自溶的缺點（Silva等，2013），因此，根據(jù)菌種生理特性，優(yōu)化效果最佳的培養(yǎng)條件和增菌培養(yǎng)基，能夠改進發(fā)酵進程，有效利用培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分，獲得高密度培養(yǎng)的糞腸球菌菌體，從而降低生產(chǎn)成本（Liu 等，2014；Zhang等，2009）。

本實驗室前期從環(huán)境中分離得到一株乳酸菌R-WL，經(jīng)鑒定為糞腸球菌，為實現(xiàn)該糞腸球菌的工業(yè)化生產(chǎn)，提高單位體積菌體密度，本研究在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，對糞腸球菌的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，利用單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、Box-Behnken試驗和響應(yīng)面分析法 （Hassani等，2015；Yoo等，2008）優(yōu)化糞腸球菌 R-WL的培養(yǎng)基成分，旨在提高發(fā)酵培養(yǎng)基中單位體積的有效活菌數(shù)，實現(xiàn)糞腸球菌的高密度培養(yǎng)，為糞腸球菌活菌制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 糞腸球菌R-WL，本實驗室分離，具有較好的益生特性。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、檸檬酸二銨2 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉 5 g、磷酸氫二鉀 2 g、硫酸鎂 0.58 g、硫酸錳0.25 g、碳酸鈣 3 g、pH 6.8，水 1000 mL。115 ℃高壓滅菌20 min；此培養(yǎng)基用于菌種活化復(fù)壯。

計數(shù)培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基成分中再加入2%瓊脂粉，煮沸后混合均勻，調(diào)節(jié)pH為6.2，115℃高壓滅菌20min，此培養(yǎng)基用于活菌計數(shù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 取凍存甘油管糞腸球菌R-WL，于MRS試管活化24 h，平板計數(shù)，挑單菌接入盛有100 mL液體MRS培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫搖床37℃、120 r/min培養(yǎng)18 h，備用。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將活化后的試管菌種按照2%的接種量接入各發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃、160 r/min條件下，培養(yǎng)14 h，檢測活菌數(shù)。

1.2.3 活菌數(shù)含量測定 根據(jù)GB/T4789.35-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗食品中乳酸菌》，采用MRS平板菌落計數(shù)法，測定菌液中糞腸球菌活菌含量。

1.3 試驗設(shè)計

好歹他們勤勞的本色不變：楊秋香該忙家務(wù)活兒還忙家務(wù)活兒，有時她也到超市幫忙干點雜活兒。楊力生該接待往來客戶，還是熱心地接待往來客戶，夫妻二人各盡其責(zé)，但就是誰也不肯先理睬誰。

1.3.1 生長曲線建立 取活化好的種子液，1%接種于盛有100 mL液體MRS培養(yǎng)基后，于37℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)，以空白MRS培養(yǎng)基為對照，將菌液用無菌MRS稀釋3倍測定初始濃度所對應(yīng)的吸光值OD600nm，每隔2 h測定一次，至48 h培養(yǎng)結(jié)束，以時間（h）為橫坐標，OD600nm為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.2 R-WL培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.2.1 糞腸球菌R-WL最適生長pH的測定取活化好的種子液，1%接種到40%裝液量 （250 mL三角瓶裝 100 mL）的不同 pH（pH=5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0） 的 MRS 培養(yǎng)基， 于 37 ℃、160 r/min培養(yǎng)14 h后測定活菌數(shù)。

1.3.2.2 糞腸球菌R-WL最適生長溫度測定 將MRS培養(yǎng)基調(diào)整pH 8.5，然后將糞腸球菌以1%的接種量接種到裝液40%的MRS培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度（T=33、35、37、39、41 ℃）的恒溫搖床中，160 r/min培養(yǎng)14 h，測定活菌數(shù)。

1.3.2.3 糞腸球菌R-WL最適接種量的測定 選擇不同接種量1%、2%、3%、5%、9%，接種到裝液量40%的MRS培養(yǎng)基中，調(diào)整pH 8.5，培養(yǎng)溫度37℃，160 r/min培養(yǎng)14 h，測定培養(yǎng)液活菌數(shù)。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.3.2 氮源的篩選 硫酸銨、蛋白胨、豆粕、豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨+酵母膏（1∶1），以 10、20、30 g/L濃度替代MRS培養(yǎng)基中復(fù)合氮源（蛋白胨、牛肉膏、酵母膏），另設(shè)MRS培養(yǎng)基為對照組，250 mL三角瓶裝液量100 mL，37℃、160 r/min培養(yǎng)14 h后用MRS培養(yǎng)基計數(shù)，做兩個平行。

1.4 Plackett－Burman設(shè)計法篩選顯著影響因素Plackett－Burman試驗設(shè)計法通過分析每個影響因素的兩個水平，比較兩水平的差異和整體的差異，從而確定每個因素的顯著性，達到快速準確篩選出主效因素的目的；根據(jù)培養(yǎng)基篩選出的最適碳源、氮源、無機鹽后，進行Plackett-Burman試驗。選取最佳碳源、最佳氮源、檸檬酸二銨、結(jié)晶乙酸鈉、檸檬酸氫二鉀、無水硫酸鎂和硫酸錳進行Plackett-Burman試驗，以篩選影響糞腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)的3個顯著影響因子。

1.5 Box-Behnken試驗設(shè)計 根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計模塊，每個顯著性因素取3個水平，以糞腸球菌R-WL活菌數(shù)對數(shù)值為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平共15個試驗點的響應(yīng)面試驗，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，繪制等高線和響應(yīng)曲面，在一定范圍內(nèi)求出最佳值，得出最佳培養(yǎng)基配方。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗結(jié)果均以 “平均數(shù)±標準差”的形式表示，利用SAS 9.3軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因子方差分析（one-way ANOVA，LSD），P<0.05和P<0.01為數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上差異顯著。試驗作圖采用Origin 9.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞腸球菌的生長曲線 根據(jù)所測菌液OD600值繪制糞腸球菌R-WL的生長曲線 （圖1），可以看到0~2 h菌體濃度上升較緩和，這是菌種進入新環(huán)境的適應(yīng)階段，為該菌種的延滯期；2~14 h糞腸球菌菌體濃度快速生長至最高峰，該時期曲線基本接近直線，說明該時期是糞腸球菌生長最快的時期，為其對數(shù)生長期；14 h之后，菌液濃度變化比較穩(wěn)定，說明此時糞腸球菌進入生長穩(wěn)定期，選取14 h為該菌種最適培養(yǎng)時間。

圖1 糞腸球菌R-WL生長曲線

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 糞腸球菌R-WL最適生長pH的測定 菌種R-WL在不同pH培養(yǎng)基中的活菌數(shù)見圖2，初始pH為7.5、8、8.5和9.0時，活菌數(shù)較高，各組間差異不顯著（P>0.05），與其他pH組差異極顯著（P<0.01），活菌數(shù)最高的pH為8.5，最終菌體濃度為3.8×109cfu/mL，說明隨著培養(yǎng)基初始pH的升高，菌種后期所產(chǎn)乳酸的中和能力增強，減輕了乳酸對菌體的毒害作用，因此，確定該糞腸球菌最適pH為8.5。

圖2 不同初始pH對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的影響

2.2.2 糞腸球菌R-WL最適生長溫度的測定 由圖3可知，不同溫度之間最終活菌數(shù)差異不顯著（P>0.05），說明菌株R-WL在37~41℃具有較強的適應(yīng)性，隨著溫度升高，活菌數(shù)先升高后下降，溫度在37℃時，菌種R-WL活菌數(shù)最高，達到3.96×109cfu/mL，說明溫度對菌種的生長具有一定影響，該菌種在溫度為37℃時，菌種的代謝最為旺盛，對營養(yǎng)物質(zhì)利用率提高，進而提高最終活菌數(shù)。因此，確定糞腸球菌R-WL最適溫度為37℃。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的影響

2.2.3 糞腸球菌R-WL最適接種量的測定 由圖4可知，不同接種量之間活菌數(shù)在P=0.01水平上差異不顯著，隨著接種量的增加，糞腸球菌RWL活菌數(shù)先升高后下降，在3%接種量時，活菌數(shù)達到最大值，為3.36×109cfu/mL，與1%接種量活菌數(shù)差異不顯著（P>0.05），但活菌數(shù)顯著高于其他各組（P<0.05），原因可能是，隨著接種量的增加，縮短了菌種R-WL的延滯期，促進了菌種迅速進入對數(shù)期，但隨著接種量超過5%以后，由于初始接種量過大，帶入較多菌種次級代謝產(chǎn)物，反而抑制了菌種的生長，因此，綜合考慮，選取3%為最適接種量。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源篩選試驗 由圖5可知，乳糖做碳源時，與玉米粉、麩皮、糖蜜、蔗糖及可溶性淀粉各組活菌數(shù)差異極顯著（P<0.01），與對照組（葡萄糖）差異不顯著（P>0.05），乳糖各濃度之間活菌數(shù)差異不顯著（P>0.05），以麩皮和可溶性淀粉做碳源時，活菌數(shù)顯著小于其他各組（P<0.05）；說明菌種R-WL能較好利用葡萄糖或乳糖，對麩皮和可溶性淀粉中的多糖較難利用，根據(jù)活菌數(shù)情況，選擇最適碳源為乳糖，最適濃度為10 g/L。

圖4 不同接種量對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的影響

圖5 不同碳源及其濃度對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的影響

2.3.2 氮源篩選試驗 由圖6可知，對照組、蛋白胨組及蛋白胨+酵母膏組活菌數(shù)大于豆餅粉組、豆粕組、花生餅粉組及硫酸銨組，蛋白胨+酵母膏組、蛋白胨組最高活菌數(shù)為3.40×109cfu/mL及3.21×109cfu/mL，豆餅粉、豆粕、花生餅粉及硫酸銨組活菌數(shù)最高分別為 0.43×109、0.38×109、0.64×109、0.07×109cfu/mL， 極顯著低于蛋白胨+酵母膏組、蛋白胨組和對照組（P<0.01）；說明菌株R-WL對動物性氮源利用較充分，對植物性氮源及無機氮源的利用效果較差，動物性有機氮源中含有糞腸球菌R-WL生長所需氨基酸等物質(zhì)，植物性氮源的氨基酸組成與菌株R-WL的生長需求不一致，無機氮源需要經(jīng)微生物代謝轉(zhuǎn)化才能合成菌株所需氨基酸；蛋白胨+酵母膏組活菌數(shù)高于其他各組，與對照組差異不顯著（P>0.05），選取蛋白胨+酵母膏為最適氮源，最適濃度為30 g/L。

圖6 不同氮源及其濃度對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的影響

2.4 Plackett-Burman試驗結(jié)果 根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果，將篩選到的最佳碳源乳糖、最佳氮源酵母膏+蛋白胨代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖、復(fù)合氮源作為優(yōu)化培養(yǎng)基的成分，并將乳糖、酵母膏、蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、碳酸鈣共9個因子作為Plackett-Burman試驗設(shè)計的基本因素，另設(shè)2個虛擬變量估計試驗誤差，各因子取高低2個水平，響應(yīng)值為單位體積糞腸球菌活菌數(shù)的對數(shù)值（Y），試驗設(shè)計見表1，其中F與L為虛擬項，試驗結(jié)果見表2。對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，可得各因子的效應(yīng)及其顯著性（表3），由表3可知，在糞腸球菌R-WL培養(yǎng)過程中，在α=0.1水平上，蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的對數(shù)值影響顯著，其中檸檬酸二銨為正效應(yīng)，蛋白胨和乙酸鈉為負效應(yīng)，因此將這3個因子做Box-Behnken試驗。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計

表2 Plackett-Burman試驗結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計各因子效應(yīng)及顯著性

2.5 最陡爬坡試驗及結(jié)果 根據(jù)Plackett-Burman試驗篩選結(jié)果，選取蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸銨為三個顯著性因子進行最陡爬坡試驗以獲取活菌數(shù)最高的區(qū)域，根據(jù)各因子的系數(shù)及實際情況，設(shè)置4個梯度，結(jié)果如表4所示，梯度0+2Δ所對應(yīng)的活菌數(shù)最高，故采用蛋白胨11 g/L、乙酸鈉4 g/L、檸檬酸二銨4 g/L為后續(xù)響應(yīng)面試驗的中心點。

表4 最陡爬坡試驗結(jié)果

2.6 響應(yīng)面設(shè)計確定顯著影響因素的最佳值采用Box-Behnken試驗設(shè)計，對蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨的濃度配比進行優(yōu)化，以活菌數(shù)的對數(shù)值為響應(yīng)值，各因子設(shè)置3個水平（見表5），優(yōu)化結(jié)果如表6所示。

表5 Box-Behnken試驗因素水平及其編碼

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken試驗結(jié)果，采用Design Expert 8.06軟件響應(yīng)面分析程序?qū)ζ溥M行回歸擬合，得到二次多元回歸模型為：Y=9.77+0.040A+0.037B+0.01C+0.01AC+0.01BC-0.042A2-0.017B2-0.013C2（Y為活菌數(shù)對數(shù)預(yù)測值，A、B、C分別代表蛋白胨、乙酸鈉和檸檬酸二銨），對所得回歸方程進行方差分析 （表7），可知：模型P值為0.0042，回歸項極顯著（P<0.01），表明本模型是有效的；失擬項P值為0.2301，失擬項不顯著（P>0.05），表明本模型不存在失擬現(xiàn)象；試驗的精確度以變異系數(shù)（CV）表示，CV值越低，試驗可靠性越強，本試驗CV值為0.16%（表8），說明試驗結(jié)果可信，R2Adj為89.88%，表明響應(yīng)面89.88%的變化可以用此回歸模型進行解釋，該模型與實際變化擬合較好，可用于糞腸球菌R-WL培養(yǎng)基優(yōu)化的預(yù)測。

表7 回歸擬合方程方差分析

表8 模型可信度分析

利用Design Expert 8.06軟件對回歸模型進行響應(yīng)面分析，繪制活菌數(shù)對數(shù)值的等高線和曲面圖（圖7~圖9），等高線圖的圓心越接近橢圓表示交互作用越強，等高線的稀疏表示響應(yīng)面圖形的平陡。從3組圖中可以直觀看出活菌數(shù)對數(shù)值存在最大響應(yīng)值，利用Design Expert 8.06軟件的Optimization模塊，對響應(yīng)值求極值，得出蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨添加量分別為12.18、4.5、4.5 g/L時，糞腸球菌R-WL的活菌數(shù)對數(shù)值存在最大值9.81221，所對應(yīng)的活菌數(shù)為6.46×109cfu/mL。

圖7 蛋白胨和乙酸鈉交互影響對糞腸球菌RWL活菌數(shù)的等高線和曲面圖

圖8蛋白胨和檸檬酸二銨交互影響對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的等高線和曲面圖

圖9乙酸鈉和檸檬酸二銨交互影響對糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的等高線和曲面圖

2.7 最優(yōu)配方驗證 為了檢驗?zāi)Ｐ偷目煽啃裕瑢?yōu)化后的培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基），在相同條件下進行5次搖瓶發(fā)酵試驗。試驗結(jié)果見圖10，優(yōu)化后培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基所得活菌數(shù)分別為（6.44±0.10）×109cfu/mL 和（3.76±0.17）×109cfu/mL，優(yōu)化后結(jié)果與預(yù)測值接近，可見模型能較好預(yù)測發(fā)酵液活菌數(shù)。

圖10 優(yōu)化前后培養(yǎng)基活菌數(shù)變化

3 討論

3.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化 乳酸菌培養(yǎng)過程中，利用培養(yǎng)基中的糖類發(fā)酵為乳酸，糞腸球菌培養(yǎng)后期，乳酸大量積累，對菌體的生長產(chǎn)生抑制作用，為減輕培養(yǎng)過程中高酸環(huán)境對菌體的毒害，經(jīng)常在培養(yǎng)過程中加入堿性物質(zhì)中和。許多研究表明，添加中和劑是提高乳酸菌活菌數(shù)的一個有效手段（閔偉紅等，2009；張廣敏等，2009）。 本研究通過調(diào)節(jié)初始pH來研究糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的變化，發(fā)現(xiàn)隨著pH升高活菌數(shù)升高，到一定程度開始下降，原因可能是較高的pH能中和發(fā)酵過程中更多的有機酸，有利于菌種的生長。

溫度是微生物生長過程中的一個重要影響因素，改變溫度會影響微生物體內(nèi)所進行的多種化學(xué)反應(yīng)（Lopes等，2018）。本試驗在33~41℃，對培養(yǎng)糞腸球菌R-WL活菌數(shù)的變化進行了研究，雖然各組活菌數(shù)差異不顯著（P>0.05），隨著溫度升高，活菌數(shù)有先上升后下降趨勢，與劉香英等（2018）的研究結(jié)果一致。溫度過高或過低可能會出現(xiàn)菌種R-WL生物合成量過低及生長延長等不良現(xiàn)象，微生物代謝的蛋白酶、淀粉酶等酶制劑活力受溫度影響，適宜的溫度能促進酶活力的發(fā)揮，有效利用營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進菌體密度的提高。

3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 碳源是微生物生長所需的重要營養(yǎng)要素，也是微生物細胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳來源的營養(yǎng)物質(zhì)（岑沛霖等，2011），不同微生物利用碳源的能力不同。本試驗研究了乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糖蜜、玉米粉和麩皮作為碳源時對菌種R-WL生長的影響，發(fā)現(xiàn)乳糖、葡萄糖對菌種的促生長效果較好，麩皮、可溶性淀粉、玉米粉的效果較差，原因可能是菌種RWL對單糖和雙糖利用較快，而麩皮、淀粉和玉米粉等多糖需要微生物產(chǎn)淀粉酶分解為二糖或單糖進行利用，菌種R-WL產(chǎn)酶能力較差導(dǎo)致對多糖的利用不充分，菌種生長受到抑制。

氮是組成核酸和蛋白質(zhì)的重要元素，其對微生物的生長發(fā)育有著重要作用。不同微生物能利用的氮源差異較大。本試驗分別研究了6種氮源對菌種R-WL的促生長效果，結(jié)果表明，蛋白胨+酵母膏組的活菌數(shù)最高，這與Djellouli等（2017）與 Kwon等（2000）研究結(jié)果相似。 蛋白胨、酵母膏中的氮以氨基酸形式存在，氨基酸可以被微生物直接吸收參與細胞代謝，而豆粕、豆餅粉、花生餅粉以蛋白質(zhì)形式存在，需要分解為氨基酸才能利用，糞腸球菌為異氧型微生物，對硫酸銨中的無機氮無法利用，可能是菌株R-WL在豆粕、豆餅粉、花生餅粉及硫酸銨中活菌數(shù)較低的原因。

3.3 響應(yīng)面試驗 響應(yīng)面法（RSM），也稱響應(yīng)曲面法，是通過對應(yīng)曲面及等高線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，用多元二次回歸方程來擬合響應(yīng)值與因素之間函數(shù)關(guān)系的一種優(yōu)化統(tǒng)計方法（Montgomery 等，2009；Box，1990）。 試驗證明，Plackett-Burman設(shè)計與響應(yīng)面方法（RSM）相結(jié)合的試驗統(tǒng)計方法能快速、有效地影響糞腸球菌R-WL液體培養(yǎng)的因素，并將顯著性因素進行建模分析，得到最佳工藝參數(shù)。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，糞腸球菌R-WL最適培養(yǎng)條件為：時間14 h、pH 8.5、溫度37℃、接種量3%、最佳碳源為乳糖、最佳氮源為蛋白胨+酵母膏。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：乳糖10 g/L、酵母膏15 g/L、蛋白胨 12.18 g/L、乙酸鈉 4.5 g/L、檸檬酸二銨4.5 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、輕質(zhì)碳酸鈣3 g/L，初始pH 8.5。將此優(yōu)化后培養(yǎng)基與原MRS培養(yǎng)基在最適培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，所得活菌數(shù)分別為（6.44±0.10）×109cfu/mL 和（3.76±0.17）×109cfu/mL，比優(yōu)化前活菌數(shù)提高了71.28%。