高效薄層色譜掃描法同時(shí)測(cè)定滁菊中木犀草素、芹菜素、金合歡素含量

蔡玉茹， 江 倩， 李灑灑， 馮順麗， 周國(guó)梁

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

滁菊(Chrysanthemummorifoliumcv.‘Chuju’ )為菊科植物菊的干燥頭狀花序，為安徽滁州地區(qū)的道地藥材[1]。在2015年藥典中將滁菊與亳菊、貢菊、杭菊、懷菊作為藥用菊花同園收錄，為現(xiàn)有具有藥食兩用的藥用植物之一[2]。滁菊味辛、甘、苦，性微寒，具有清肝明目、疏散風(fēng)熱等功效，對(duì)于肝陽(yáng)上亢引起的眩暈具有較好的治療效果[3-4]。研究表明滁菊對(duì)大鼠心肌缺血具有較好的保護(hù)作用[5-6]，能夠提高大鼠耐疲勞作用[7]，具有較好的抗氧化性[8]，對(duì)DPPH具有較好的清除作用[9]。

滁菊現(xiàn)常作為一種健康保健食品，但市場(chǎng)流通的滁菊質(zhì)量差異較大，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行分析和確定有重要意義[10-11]。采用總成分已經(jīng)不能對(duì)其質(zhì)量差異進(jìn)行有效評(píng)估，對(duì)其質(zhì)量成分分析現(xiàn)多采用HPLC法進(jìn)行定量分析[12-13]，但因其樣品前處理方法復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，多樣品的分析顯然不能夠滿足現(xiàn)有的食品快速檢測(cè)分析質(zhì)量管理要求[14-16]。高效薄層色譜掃描法(HTLCS)能夠采用薄層對(duì)成分進(jìn)行分離，并通過掃描對(duì)其測(cè)定成分定量分析，能夠?qū)Χ鄠€(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行分析，且分析方法簡(jiǎn)便，能夠快速對(duì)滁菊成分進(jìn)行定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LINOMAT5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀(瑞士CAMAG公司)；TLC VISALIZER 薄層色譜成像文件系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)；TLC SCANNER 3薄層色譜掃描儀(瑞士CAMAG公司)；GF254薄層硅膠板(青島海洋化工有限公司)；DHG-9140電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵(鄭州英峪予華儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；ZNHW-Ⅱ電熱套(鄭州科華儀器設(shè)備有限公司)；CP225D準(zhǔn)微量天平(德國(guó)賽多利斯公司)；JK-250DB數(shù)控超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)；雙槽層析缸(上海信宜儀器廠)。

木犀草素對(duì)照品(批號(hào)：1309-08),芹菜素對(duì)照品(批號(hào)：15032610),均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；金合歡素對(duì)照品(批號(hào)：20170612，上海詩(shī)丹德科技生物有限公司)；甲醇等試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。滁菊購(gòu)于安徽滁州菊泰有限公司，批號(hào)：201708，經(jīng)安徽科技學(xué)院中藥學(xué)教研室劉漢珍教授鑒定為正品滁菊。

1.2 高效薄層掃描法

1.2.1 供試品溶液的配制 精密稱取滁菊1.000 g，剪碎，加石油醚(30～60 ℃) 20 mL超聲處理30 min，濾過，藥渣揮發(fā)加稀鹽酸1 mL與乙酸乙酯50 mL超聲處理30 min濾過，濾液水浴蒸干，得到的殘?jiān)蛹状? mL使其溶解，轉(zhuǎn)移到5 mL容量瓶中搖勻，作為供試品溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇配成濃度為木犀草素0.2 mg/mL、芹菜素0.2 mg/mL、金合歡素0.2 mg/mL，精密分別量取上述3種成分的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL，添加甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即可得不同濃度的混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 薄層層析及薄層掃描條件 GF254薄層硅膠板(20 cm×10 cm)，條狀點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為2 μL，試驗(yàn)前置110 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中活化30 min后，在干燥環(huán)境中放冷，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸∶水=17∶7∶3∶2上層溶液為展開劑上行展開80 mm，雙槽展開缸展開，取出，晾干，以1%AlCl3顯色，于365 nm紫外燈下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯示出相同顏色的亮黃色斑點(diǎn)(圖1)。對(duì)木犀草素、芹菜素、金合歡素對(duì)照品斑點(diǎn)及供試品中相應(yīng)的斑點(diǎn)在365 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行直線掃描檢測(cè)，狹縫寬度為6.0 mm×0.3 mm，如圖2～3，測(cè)量供試品吸光度積分值和對(duì)照品吸光度積分值并計(jì)算。

A.木犀草素 B.金合歡素 C.芹菜素7～8 混合標(biāo)準(zhǔn)品,1～6,9～14均為滁菊樣品

圖2 供試品溶液薄層色譜3D展開圖

1.木犀草素 2.金合歡素 3.芹菜素

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

使用半自動(dòng)點(diǎn)樣儀分別吸取木犀草素、金合歡素和芹菜素對(duì)照品溶液，以點(diǎn)樣量1、2、3、4、5、6 μL分別點(diǎn)于GF254薄層硅膠板上，進(jìn)行展開，成像，掃描。以對(duì)照品點(diǎn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：木犀草、芹菜素、金合歡素在進(jìn)樣量范圍內(nèi)，點(diǎn)樣量與峰面積積分值有良好的線性關(guān)系(表1)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 同板的精密度試驗(yàn)

精密吸取木犀草素、芹菜素、金合歡素混合對(duì)照品溶液，交叉點(diǎn)于薄層板上各點(diǎn)6個(gè)條帶，每條帶1 μL，按上述薄層色譜條件展開后掃描，測(cè)定木犀草素、芹菜素、金合歡素峰面積積分值的RSD 分別為1.40%、1.57%、1.59%;表明該方法精密度良好。

2.3 異板的精密度試驗(yàn)

精密吸取木犀草素、芹菜素、金合歡素混合對(duì)照品溶液，交叉點(diǎn)于不同的薄層板上各點(diǎn)6個(gè)條帶，每條帶2 μL，按上述薄層色譜條件展開后掃描，測(cè)定木犀草素、芹菜素、金合歡素峰面積積分值的RSD分別為1.45%、1.58%、1.60%;表明該方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在同一 GF254薄層硅膠板上交叉點(diǎn)對(duì)照品溶液1、2、3 μL，供試品溶液1 μL，按色譜條件及掃描條件對(duì)對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定，每隔30 min掃描一次，峰面積積分值在2.5 h內(nèi)基本保持不變，RSD分別為1.23%、1.07%、1.50%，表明2.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按1.2.1節(jié)下的方法配制相同濃度的供試品溶液6份，分別測(cè)定木犀草素、芹菜素、金合歡素的含量，結(jié)果表明木犀草素、芹菜素、金合歡素峰面積積分值的RSD分別為1.81%、1.67%、1.69%;表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量的供試品溶液3份200 μL，各加入對(duì)照品200 μL，混合均勻。分別吸取上述混合液2 μL點(diǎn)于同一GF254薄層硅膠板上，按色譜條件及掃描條件對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果測(cè)定木犀草素、芹菜素、金合歡素的平均回收率為99.9%、100.6%、101.3%，RSD分別為1.55%、1.41%、1.64%,表明該方法回收率良好(表2)。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品含量測(cè)定試驗(yàn)

取6批樣品按1.2.1節(jié)方法配制成6份供試品溶液。精密吸取供試品溶液2 μL、混合對(duì)照品溶液2 μL和4 μL,分別交叉點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，按薄層層析及薄層掃描條件分別測(cè)定木犀草素、芹菜素、金合歡素的含量(表3)。

表3 薄層掃描法測(cè)定木犀草素、芹菜素、金合歡素的結(jié)果

3 結(jié)論與討論

藥用植物中成分較為復(fù)雜，對(duì)其質(zhì)量差異性不能簡(jiǎn)單采用單一成分進(jìn)行判定，應(yīng)采用多成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[17]。在2015版《中國(guó)藥典》中對(duì)菊花進(jìn)行定量分析中對(duì)單一成分進(jìn)行了定量分析[2]，該方法并不能完全體現(xiàn)滁菊質(zhì)量差異性，因此可以采用多成分進(jìn)行綜合定量分析，才能真實(shí)體現(xiàn)其質(zhì)量的差異性[17]。本試驗(yàn)建立滁菊3種主要成分HTLCS分析方法，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行定量分析，并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，在對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)方面更全面，具有實(shí)用性，體現(xiàn)滁菊質(zhì)量差異性，為保障滁菊的安全應(yīng)用提供依據(jù)。

薄層掃描法具有分離效能高、快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，同時(shí)薄層板上色斑點(diǎn)穩(wěn)定性較差且易受其他因素影響，如薄層板的均勻度,板間差異,點(diǎn)樣量的準(zhǔn)確與否以及顯色劑的噴霧均勻度及環(huán)境溫度等[16]；而HPLCS法操作簡(jiǎn)單,精確度高，重現(xiàn)性好。HTLCS法具有分離分析雙重功能，對(duì)樣品的預(yù)處理要求不高，可以在同一塊硅膠板上點(diǎn)樣多個(gè)樣品，能夠同時(shí)展開分析，展開劑可以根據(jù)分離效果進(jìn)行調(diào)配，選擇范圍寬且用量少，更換方便[16]。目前隨著該方法儀器自動(dòng)化程度的提高，檢測(cè)的靈敏度、精密度與準(zhǔn)確度均有較大的提升，在食品藥品分析檢測(cè)中逐漸成為重要的分析方法。