七氟醚對大鼠海馬組織NR2B、Caspase-3的影響*

朱彥東,劉 鈺

(1.南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院麻醉科，廣東深圳 518101；2.浙江省東陽市紅十字會醫(yī)院 322100)

隨著麻醉藥物在臨床的廣泛使用，人們開始關(guān)注全身麻醉藥對腦發(fā)育的影響。近年來有研究顯示，異氟烷等全身麻醉藥會導(dǎo)致神經(jīng)細胞的凋亡，具有一定的神經(jīng)毒性[1-2]。目前，發(fā)育期動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)成為研究熱點，但是對于麻醉藥導(dǎo)致神經(jīng)細胞退化和凋亡的具體機制仍未十分明確。N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA受體)是離子型谷氨酸受體的1個亞型，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。研究顯示，N-甲基-D-天冬氨酸-2B受體(NR2B)不僅介導(dǎo)突觸的強化及神經(jīng)元的存活，還可介導(dǎo)細胞凋亡[3]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,其中Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用[4]。本研究探討七氟醚對大鼠海馬組織NR2B、Caspase-3的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取SD大鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)60只，7 d齡，雌雄各半，飼養(yǎng)環(huán)境為12 h明暗循環(huán)，溫度20～22 ℃，濕度55%～60%，大鼠斷奶前配乳母鼠喂養(yǎng)，自由取食。將大鼠分為對照組和麻醉組，每組再分為3個時間點，即麻醉前、麻醉后24 h及麻醉后7周，每組10只。

1.2方法

1.2.1麻醉方法 大鼠放入麻醉箱，對照組開啟30%空氧混合氣；麻醉組開啟七氟醚(濃度2.5%)和30%空氧混合氣，麻醉時間4 h。

1.2.2Western blot 分別于麻醉前、麻醉后24 h及麻醉后7周取大鼠海馬組織，收集蛋白樣品使用細胞裂解液，BCA 蛋白定量法檢測各組蛋白濃度。NR2B用10%分離膠，冷卻到室溫，把蛋白樣品直接上樣到十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳加樣孔內(nèi)，每孔上樣量30 μg，打開電泳儀，上層膠時使用80 V電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用120 V電壓恒壓電泳。恒流 0.22 mA 濕轉(zhuǎn)120 min，轉(zhuǎn)膜完畢后漂洗，5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h。參考一抗說明書，按照適當比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗，4 ℃過夜。洗滌，按照適當比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育1 h。漂洗后進行化學發(fā)光，根據(jù)一抗的不同，選擇合適的曝光時間顯影并保存圖像。

1.2.3Morris水迷宮測試 Morris水迷宮檢測麻醉后7周大鼠的空間學習記憶能力。大鼠Water Maze水迷宮為上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，由圓形水池、圖像自動采集和處理系統(tǒng)組成。Morris水迷宮測試包括定位航行實驗(place navigation)和空間搜索實驗(spatial probe test)，實驗訓(xùn)練階段連續(xù)進行3 d，每天訓(xùn)練4次。觀察和記錄大鼠尋找并爬上平臺的路線圖及所需時間，記錄為潛伏期。

2 結(jié) 果

2.1兩組海馬組織NR2B蛋白表達情況 麻醉前及麻醉后7周，麻醉組和對照組大鼠海馬組織NR2B蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；麻醉后24 h，麻醉組大鼠海馬組織NR2B蛋白表達明顯高于對照組及麻醉前(P<0.05)，見圖1。

圖1 兩組海馬組織NR2B蛋白表達變化

圖2 兩組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達

表1 各組Morris水迷宮測試情況

2.2兩組海馬組織Caspase-3蛋白表達情況 麻醉前及麻醉后7周，麻醉組和對照組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；麻醉后24 h，麻醉組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達明顯高于對照組及麻醉前(P<0.05)，見圖2。

2.3兩組大鼠Morris水迷宮測試情況 將麻醉后7周大鼠進行Morris水迷宮測試，麻醉組大鼠第1、3天游泳潛伏期、總路程明顯高于對照組(P<0.05)。麻醉組和對照組游泳速度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

3 討 論

目前針對全身麻醉藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響的報道較多。研究顯示，麻醉藥會導(dǎo)致神經(jīng)細胞的凋亡，對發(fā)育期動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有不可逆轉(zhuǎn)的損害[5]。閔娜等[6]將發(fā)育高峰期的大鼠暴露在異氟醚中超過5 h，發(fā)現(xiàn)大鼠的神經(jīng)細胞發(fā)生廣泛的退化和死亡。七氟醚為臨床上常用的吸入麻醉藥，廣泛應(yīng)用于兒童手術(shù)，隨著越來越多地應(yīng)用在臨床，其對神經(jīng)、心臟系統(tǒng)的不良反應(yīng)也受到研究者的關(guān)注。之前已有許多關(guān)于七氟醚對神經(jīng)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)認知功能的影響的報道。謝思寧等[7]研究報道，七氟醚對幼鼠發(fā)育期中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有損害作用。CIECHANOWICZ等[8]將懷孕大鼠長期暴露超劑量的異氟醚中，發(fā)現(xiàn)幼鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)發(fā)生延遲，但其具體作用機制目前尚未明確。

NMDA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其在大腦皮層和海馬廣泛分布。海馬體(Hippocampus)是位于腦顳葉內(nèi)的一個部位，主要負責長時記憶的存儲轉(zhuǎn)換和定向等功能[9]。NMDA 受體具有不同的亞型，與學習、記憶等多種神經(jīng)功能密切相關(guān)。研究顯示，NMDA 受體參與誘導(dǎo)細胞的存活和凋亡，在神經(jīng)元細胞的壞死、凋亡和抗凋亡過程中發(fā)揮重要作用[10]。NR2B亞基主要表達于發(fā)育早期階段，對NMDA受體的功能起著重要作用。因此本研究選擇NR2B 為大鼠發(fā)育期的監(jiān)測指標。Caspase家族與細胞凋亡密切相關(guān)，引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)[11-12]。Caspase-3在死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡途徑中起關(guān)鍵作用[13]。本研究結(jié)果顯示，麻醉后24 h，麻醉組大鼠海馬組織NR2B蛋白和Caspase-3蛋白表達明顯高于對照組及麻醉前(P<0.05)；麻醉前及麻醉后7周，麻醉組和對照組大鼠海馬組織NR2B蛋白和Caspase-3蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。七氟醚麻醉對幼鼠海馬組織NR2B、Caspase-3蛋白表達影響較大，說明七氟醚麻醉對小鼠認知功能影響的機制與海馬組織NR2B、Caspase-3蛋白表達有關(guān)，但具體的影響機制目前尚不明確，其長期效應(yīng)有待進一步研究。

Morris水迷宮測試可很好地反映大鼠海馬的功能，是研究空間學習記憶的標準實驗，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學領(lǐng)域研究[14]。Morris水迷宮測試通過在水中設(shè)置隱藏平臺，記錄實驗動物尋找平臺所用時間和所走路徑，判斷動物的記憶功能，研究與空間學習記憶相關(guān)的腦區(qū)功能評價。本研究中，麻醉組大鼠第1、3天游泳潛伏期、總路程明顯高于對照組(P<0.05)，游泳速度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。因此筆者認為，大鼠接受2.5%七氟醚麻醉4 h會造成海馬功能長期損害，影響記憶功能，這與王權(quán)等[15]研究結(jié)果一致。2.5%七氟醚對大鼠的運動能力無明顯損害。七氟醚可能通過作用于NMDA受體，引起行為異常和學習、記憶功能障礙的發(fā)生，具體的機制仍需要進一步研究。

綜上所述，七氟醚麻醉可即刻造成幼鼠海馬組織NR2B、Caspase-3蛋白表達升高，成年海馬功能長期損害，影響記憶功能。但成年后海馬組織NR2B、Caspase-3蛋白表達無明顯異常，值得進一步研究。