下調(diào)claudin-1對膽囊癌細胞SGC996生物學(xué)行為的影響

復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是膽囊癌不良預(yù)后的重要因素之一[1]。腫瘤的進展存在基因的參與[2]。緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致細胞增殖、分化異常在腫瘤的進展中起作用。緊密連接蛋白如Claudin的丟失與重排，被認為是惡性腫瘤進展及其觸發(fā)機制重要的原因[3]。Claudin-1是緊密連接蛋白中的一個亞型，前期研究發(fā)現(xiàn)其蛋白在膽囊癌組織中升高且與病程分期具有一定的相關(guān)性[4]與有些研究[5]有偏差，本研究下調(diào)Claudin-1在膽囊癌細胞SGC996中的表達，檢測其對膽囊癌細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

膽囊癌細胞SGC996、GBC-SD、膽管癌細胞QBC939均購自上海吉凱基因公司；DMEM購自Corning、胎牛血清購自Ausbian；Trizol購自上海普飛公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV購自Promega公司；PCR引物由廣州市銳博生物科技有限公司合成；慢病毒感染相關(guān)試劑：胰酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司；嘌呤霉素購自Clontech公司；MTT購自Genview公司；PI購自Sigma公司；凋亡試劑盒購自eBioscience；protein-dye購自Bio-Rad公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；兔抗人Bax蛋白單克隆抗體、兔抗人Bcl-2蛋白單克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自Bioworld公司；羊抗鼠和羊抗兔二抗均購自上?？党缮锕?；構(gòu)建質(zhì)粒所用限制性內(nèi)切酶及T4連接酶購自NEB公司Transwell（孔徑8μm）購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR法 引物：GAPDH上游5'-TGACTTCAACAGCGA CACCC和 下 游5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA，claudin-1上 游5'-AAAGTGAA GAAGGCCCGTATA和下游5'-TAATGTTGGTAGGG ATCAAAGG。反應(yīng)體系：SYBR 10.0 μL，上游引物（2.5 μM）2 μL，下游引物（2.5 μM）2 μL，cDNA2.0μL，RNase-FreeH2O 4.0 μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 10 min，94 ℃變性 15 s、60 ℃退火 20 s、72 ℃延伸15 s，45個循環(huán)。

1.2.2 LV-CLDN1-RNAi感染SGC996細胞 LV-CLDN1-RNAi沉默Claudin-1基因，陰性CON077。實驗組為KD、對照組為NC和空白對照組為MOCK。感染后8～12 h，感染效率達到70%以上，繼續(xù)實驗。熒光標記的慢病毒感染。感染后72 h左右，熒光顯微鏡觀察報告基因的表達情況，熒光率即為陽性感染率；抗性基因標記的慢病毒感染。一般于感染48～72 h后，換用含puromycin的培養(yǎng)基篩選細胞，感染效率合格用于下游檢測。

1.2.3 MTT法檢查細胞增殖 鋪板細胞密度為2 000 cell/well，鋪板數(shù)量（檢測5天，鋪5張96孔板）。觀察細胞密度，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。終止前4 h加入20 μL 5 mg/mL的MTT于孔中，4 h后完全除去培養(yǎng)液，加100 μL DMSO溶3/3解甲瓚顆粒。振蕩器振蕩2～5 min，酶標儀490/570 nm檢測OD值。

1.2.4 流式細胞儀檢查細胞周期 細胞數(shù)目≥106/處理。懸浮細胞，收集。離心，4℃預(yù)冷的D-Hanks（pH=7.2～7.4）洗滌1次。4℃預(yù)冷的75%乙醇固定至少1 h。D-Hanks洗滌，細胞染色液配制：40×PI母液（2 mg/mL）：100×RNase母液（10 mg/mL）：1×D-Hanks=25：10∶1 000，加入細胞染色液（0.6-1mL）重懸，使上機時細胞通過率為300～800 Cell/s，上機檢測。

1.2.5 AnnexinV-APC單染色法檢查細胞凋亡 細胞數(shù)目≥5×105/處理。離心，棄上清，D-Hanks洗滌沉淀。1×binding buffer洗滌沉淀，離心，收集細胞。200μL 1×binding buffer重懸細胞沉淀。加入10 μL Annexin V-APC染色，補加400～800μL 1×binding buffer。

1.2.6 Transwell實驗檢查細胞侵襲 Matrigel膠4℃過夜，與1 640培養(yǎng)基以1∶8稀釋以每孔50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面風(fēng)干。轉(zhuǎn)染48 h的細胞并調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，取200 μL接種于上層小室，小室加入600 μL培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室吸除培養(yǎng)基，擦凈Transwell小室濾膜上層的Matrigel膠及未穿過濾膜的細胞，95%酒精固定5 min，4 g/L結(jié)晶紫溶液染色1 h。

1.2.7 Western blotting檢查凋亡相關(guān)基因Bax及Bcl-2蛋白表達水平 加入裂解液100 μL和酶抑制劑1 μL的冰上裂解30 min，10 000 g離心10 min，吸取清亮層，Bradford法蛋白定量。以12%SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)膜，室溫下?lián)u床封閉1 h，加入用TBS稀釋一抗，TBS洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫下?lián)u床作用1 h，TBS洗膜后化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，計量資料以（均數(shù)±標準差）表示，兩個樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多于兩組樣本均數(shù)的比較，采用方差分析（ANOVA），以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR法檢測膽囊癌細胞SGC996、GBC-SD、膽管癌細胞QBC939中claudin-1mRNA表達

claudin-1mRNA在QBC939，SGC996中的表達豐度為高，在GBC-SD中的表達豐度為中。后續(xù)功能學(xué)研究選用claudin-1mRNA表達相對較高的SGC996為實驗細胞（見表1及圖1）。

2.2 LV-CLDN1-RNAi感染SGC996細胞后claudin-1mRNA

相比陰性對照組，感染了LV-CLDN1-RNAi后膽囊癌細胞SGC996中KD2組中claudin-1mRNA的表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 [（1.004±0.104）vs.（0.156±0.023），P=0.000 2]。敲除效率達到84.4%（見圖2和圖3）。

圖1 SGC996、GBC-SD、QBC939中claudin-1mRNA表達

圖2 感染前后細胞熒光圖片

圖3 SGC996細胞感染了LV-CLDN1-RNAi后claudin-1mRNA的表達

2.3 MTT法檢查細胞增殖

MTT結(jié)果見圖2所示。感染了LV-CLDN1-RNAi的膽囊癌細胞SGC996，在轉(zhuǎn)染后1、2、3、4天生長速度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在5天生長速度有所增加，雖然T-test分析P＜0.05，但差異倍數(shù)不足20%，仍判定為陰性。結(jié)果提示下調(diào)claudin-1對細胞增殖無明顯影響（見圖4）。

圖4 細胞生長曲線

2.4 流式細胞儀檢查細胞周期

流式細胞儀檢測顯示，KD組膽囊癌細胞SGC996，其G1期細胞明顯增多 [（53.39±0.40）%vs.（43.00±0.56）%，P=0.000 013]，S期細胞明顯減少 [（30.05±0.66）%vs.（39.64±0.54）%，P=0.000 4]，G2/M期細胞比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[（16.55±0.34）%vs.（17.35±0.72）%，P＞ 0.05]。說明大量細胞阻滯在G0/G1期。結(jié)果表明下調(diào)claudin-1具有抑制膽囊癌細胞G1/S轉(zhuǎn)化的作用（見圖5）。

2.5 AnnexinV-APC單染色法檢查細胞凋亡

KD組膽囊癌細胞凋亡比例明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明下調(diào)claudin-1對膽囊癌細胞具有促進凋亡的作用（見圖6）。

2.6 Transwell法檢查細胞侵襲

細胞要突破Matrigel膠才能轉(zhuǎn)移到多孔膜下表面。因Matrigel膠模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)，故通過transwell實驗?zāi)軝z測細胞的侵襲能力。結(jié)果顯示KD組細胞侵襲能力受到抑制（見圖7）。

圖5 細胞周期變化

圖6 細胞凋亡變化

圖7 細胞侵襲能力

2.7 Western blotting檢查凋亡相關(guān)基因Bax及Bcl-2蛋白表達水平

Western blot結(jié)果顯示KD組凋亡促進基因Bax的蛋白表達增加，凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達下降（見圖8）。

3 討論

圖8 凋亡相關(guān)基因的表達

Claudin蛋白有24種亞型被發(fā)現(xiàn)，Claudin-1為位于人染色體3q28-q29 的基因，編碼 211 個氨基酸，參與細胞間的黏附調(diào)節(jié)。Claudin-1影響腫瘤的進展等生物學(xué)行為[6-7]。關(guān)于Claudin-1在腫瘤中作用，已有報道[8-10]。Suren D等[11]發(fā)現(xiàn)Claudin-1在鼻翼癌腫瘤組織和非腫瘤上皮中的表達無顯著差異且與腫瘤預(yù)后無差異。在口腔鱗狀細胞癌中Claudin-1被發(fā)現(xiàn)高表達，提示腫瘤不良預(yù)后[12]。Holczbauer á等[13]應(yīng)用免疫組化和Western blotting檢測肝癌、癌旁肝硬化組織及正常肝臟組織中Claudin-1的表達，在肝癌和乙肝相關(guān)性肝硬化組織表達顯著升高。Bouchagier KA等[14]同樣研究肝癌發(fā)現(xiàn)，肝癌組織Claudin-1的高表達可能與生存率提高有關(guān)。Matsuoka T等[15]報道claudin-1的表達上調(diào)預(yù)示著腫瘤的侵襲和發(fā)展。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌中claudin-1明顯高表達。Süren D等[16]研究提示claudin-1的表達缺失與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及神經(jīng)侵犯密切相關(guān)。郭興軍等[17]的研究表明claudin-1在膽管癌中高表達與膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。

前期研究發(fā)現(xiàn)claudin-1蛋白在膽囊癌組織中明顯升高[4]與有些研究[5]有偏差，實驗發(fā)現(xiàn)claudin-1mRNA在QBC939，SGC996中的表達豐度為高。后續(xù)對claudin-1mRNA表達相對較高的SGC996細胞進行功能實驗。結(jié)果流式細胞儀檢測細胞周期提示下調(diào)claudin-1具有抑制膽囊癌細胞增殖及 G1/S期轉(zhuǎn)化的作用。AnnexinV-APC單染色法檢查細胞凋亡發(fā)現(xiàn)下調(diào)claudin-1后凋亡細胞明顯增多，且Western blot 法檢測提示下調(diào)claudin-1基因后膽囊癌細胞中，促進基因Bax的蛋白表達增加，凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達下降，進一步說明下調(diào)claudin-1基因可以促進膽囊癌細胞凋亡。Transwell實驗證明下調(diào)claudin-1后膽囊癌細胞侵襲能力受到抑制。研究結(jié)果與Atsushi Shiozaki等[18]在胃癌中研究結(jié)果相一致，他們報道下調(diào)claudin-1后抑制胃癌細胞增殖，侵襲及轉(zhuǎn)移，促進其凋亡。Liu Y等在乳腺癌細胞中實驗也提示下調(diào)claudin-1基因后促進凋亡其機制同樣是通過TNF-α表達引起的。通常，claudin-1作為緊密連接蛋白參與細胞間粘附，其下調(diào)可能會促進細胞的遷徙，然而前述的研究結(jié)果并非如此，可能的機制為下調(diào)claudin-1基因誘導(dǎo)細胞漿內(nèi)TNF-α表達進而激活一系列信號通路導(dǎo)致凋亡發(fā)生[19]。Jilian L Pope等[20]研究提示claudin-1過表達加快腫瘤的生長和進展，提示不良預(yù)后，其機制可能通過激活Wnt信號通路有關(guān)。

總之，研究發(fā)現(xiàn)claudin-1基因在膽囊癌細胞的增殖、凋亡和侵襲中起作用，其具體的分子機制如何將可作為后續(xù)研究的靶點，明確機制也可能使claudin-1基因成為新的膽囊癌基因靶向治療的新希望。