DD3mRNA聯(lián)合生物學(xué)技術(shù)在前列腺癌診治中的價值

前列腺癌（prostate cancer，PC）作為西方發(fā)達(dá)國家男性第二死亡率的惡性腫瘤，其發(fā)病率一直居高不下[1]。雖然我國前列腺癌的發(fā)病率低于歐美國家，但是隨著中國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會水平的提高，人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈上升趨勢[2]。局限性PC可以治愈，但是后期卻無法治愈，因此對PC的早期診斷能夠提高該病的治愈率[3]。血清PSA（serum PSA，sPSA）檢查是最為常用的指標(biāo)之一，但是其特異性較低，而且在BPH、前列腺炎和其他非惡性前列腺疾病的患者紅也會升高[4-5]。因此需要更加特異性的腫瘤標(biāo)準(zhǔn)無用于PC的診斷，而DD3（differential display code 3）基因在PC表達(dá)時顯著增高。DD3mRNA可以在PC細(xì)胞中高度表達(dá)，與正常組織相比要增加了34倍之多[6]。DD3基因特異性地高度表達(dá)人類PC細(xì)胞中，而在正常的前列腺中表達(dá)極低或不表達(dá)。因此DD3基因可能是一種早期診斷前列腺癌、判斷其預(yù)后的有前途的標(biāo)志物。本研究主要是觀察尿液DD3mRNA定量檢測聯(lián)合分子生物學(xué)技術(shù)在前列腺癌診治中的價值及其臨床應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2016年1月—2017年12月前列腺癌及前列腺增生患者作為研究對象，研究組為45例PC患者，年齡59～78歲，平均年齡為（68.72±8.49）歲；按照Gleason分級，將PC患者分為三組；其中，高分化癌16例，年齡62～74歲，平均年齡為（68.36±6.35）歲；中分化14例，年齡60～78歲，平均年齡為（69.85±8.36）歲；低分化15例，年齡59～75歲，平均年齡為（72.68±5.76）歲。將前列腺增生患者44例及非前列腺疾病者44例作為對照研究，年齡49～75歲，平均年齡為（68.28±6.21）歲。研究組與對照組患者在一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。為避免主觀因素的影響對所有研究對象采用雙盲設(shè)計手機(jī)標(biāo)本和進(jìn)行檢驗(yàn)。所有研究對象均簽署知情同意書，本次研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 尿液標(biāo)本留取 取研究對象經(jīng)前列腺按摩后的全部尿液20～30 mL并立刻放入冰箱中進(jìn)行冷卻。在4℃ 3 000 rpm下進(jìn)行離心10 min后去上清液收集尿沉渣。使用預(yù)冷D-hanks也洗滌兩次后轉(zhuǎn)移至1.5 mL凍存管中液氮保存。

1.2.2 RNA提取 取尿沉渣加入0.8 mL RNAiso Reagent后勻漿后在室溫下靜置5 min，加入1/5 RNAiso Reagent體積量的氯仿并劇烈震蕩混勻，室溫靜置5分鐘，然后再12 000 rpm 4℃下離心15 min，將上層水相等體積的異丙醇顛倒混勻，室溫靜置10 min，12 000 rpm 4℃離心10 min，去上清液用1 mL 78%預(yù)冷乙醇洗滌沉淀，12 000 rpm 4 ℃離心5 min，徹底去除乙醇得到的RNA沉淀，干燥后用適量的DEPC處理水溶液沉淀。

1.2.3 cDNA的合成 將尿液標(biāo)本中提取到的總RNA再紫外線分光光度儀上測定其280 nm和260 nm的吸光度，從而判斷RNA樣本的純度并對其進(jìn)行定量分析。去總RNA 2 μg用于cDNA的合成。CDNA的合成20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。

1.2.4 分子生物學(xué)反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)，使用20 μL PCR反應(yīng)體系，并配制PCR反應(yīng)液。其反應(yīng)條件94℃ 2 min，1 Cycles；94℃ 30 sec、60℃ 30 sec、72℃ 1 min，各 30 Cycles。

瓊脂糖凝膠電泳鑒定，先先進(jìn)行電泳緩沖液，瓊脂糖溶液，6×Loading Buffer等試劑的配制和準(zhǔn)備。去PCR反應(yīng)液5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR產(chǎn)物，同時進(jìn)行半定量測定。

1.2.5 觀察指標(biāo) 觀察三類患者尿DD3mRNA濃度、β-actin濃度、DD3相對定量的情況以及前列腺癌患者各臨床特性的DD3mRNA相對定量值的情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，兩個樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多于兩組樣本均數(shù)的比較，采用方差分析（ANOVA），以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)用生物學(xué)檢測對相對定量測定的結(jié)果

前列腺癌患者尿DD3 mRNA的濃度、β-actin濃度、DD3相對定量值均高于非前列腺疾病者以及前列腺增生者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳情見表1。

表1 三類患者DD3mRNA的相對定量值比較（±s）

表1 三類患者DD3mRNA的相對定量值比較（±s）

類型DD3mRNA濃度 β-actin濃度 DD3相對定量非前列腺疾病者（n=44） 0.016±0.003 0.368±0.010 0.043±0.012前列腺良性增生（n=44） 0.020±0.008 0.321±0.009 0.077±0.021前列腺癌（n=45） 1.152±0.185 1.918±0.283 1.101±0.138 F值 9.278 11.542 3.875 P值 0.000 0.000 0.003

2.2 DD3mRNA相對定量值與前列腺癌患者臨床病例特征的關(guān)系

低分化前列腺癌患者尿DD3 mRNA的相對定量值高于中分化、高分化者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；血清PSA水平不同患者DD3m RNA的表達(dá)不同，血清PAS 4～10 mg/L的患者DDmRNA相對定量值最高（P＜0.05）；而不同臨床分期的DD3mRNA相對定量值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同前列腺體積的DD3mRNA相對定量值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳情見表2。

表2 DD3相對定量值與相關(guān)臨床病例特征表（±s）

表2 DD3相對定量值與相關(guān)臨床病例特征表（±s）

臨床特征 DD3mRNA相對定量值 F/t值 P值Gleason評分/分化程度高分化（n=16） 0.568±0.162中分化（n=14） 1.095±0.381 6.723 0.000低分化（n=15） 1.449±0.408血清PSA水平（mg/L）≤4（n=9） 1.113±0.572 4～10（n=5） 1.631±0.438 2.452 0.034≥10（n=31） 0.865±0.401臨床分期（TNM分期）T1～ T2（n=30） 0.992±0.459 0.758 0.759 T3～ T4（n=15） 1.052±0.594前列腺體積（mL）≤63（n=18） 0.821±0.328 0.873 0.625＞63（n=27） 1.159±0.589前列腺內(nèi)腺體積（mL）≤22（n=22） 0.958±0.401 0.895 0.628＞22（n=23） 1.059±0.589

3 討論

癌癥患者生存率的提高有賴于疾病的早期診斷和治療，但是由于前列腺癌在早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)[7]?；颊呔驮\時多為失去根治機(jī)會的晚期病理或已經(jīng)發(fā)生了骨肺轉(zhuǎn)移[8]，而前列腺癌是一種由治愈可能的惡性腫瘤，能夠在早期診斷具有非常重要的意義。

國外研究PSA在0～4 ng/mL其假陽性率位25%，而假陽性率為38%～48%[9]；同時當(dāng)PSA正常時只有當(dāng)直腸指診懷疑前列腺癌，醫(yī)院才會進(jìn)行活檢。通過多次臨床試驗(yàn)顯示，DRE能夠發(fā)現(xiàn)15%左右的經(jīng)PSA測定PSA＜4.0 ng/mL的PC患者[10]。在血清PSA＞4.0 ng/mL的人群中，經(jīng)前列腺超聲引導(dǎo)下活檢診斷為前列腺癌患者只有27%，這就意味著有73%的前列腺穿刺活檢著不能診斷為前列腺癌[11]。DD3基因是由Bussenmakers等人發(fā)現(xiàn)的一種PC特異基因。近年來人們分子生物學(xué)的研究方法發(fā)現(xiàn)了多種公認(rèn)的PC標(biāo)志物，在PC診斷中能夠有較高的特異性，而DD3就是其中的一種，研究證實(shí)其在PC表達(dá)時顯著增高[12]。研究發(fā)現(xiàn)尿液DD3mRNA定量檢測聯(lián)合分子生物學(xué)技術(shù)在前列腺癌診治中具有重要的價值，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子生物學(xué)技術(shù)，能夠準(zhǔn)確和快速的檢測PC。在臨床上PT-PCR技術(shù)在前列腺組織穿刺細(xì)胞學(xué)活檢和體液（血液、尿液和前列腺按摩液）檢測中應(yīng)用，運(yùn)用實(shí)時定量的RT-PCR技術(shù)，能夠準(zhǔn)確化的檢查DD3[13]。其具有診斷前列腺癌和判斷其預(yù)后的價值。國內(nèi)陳占國等人研究發(fā)現(xiàn)，未治療前列腺癌患者外周學(xué)DD3陽性率為100%，而前淚腺良性增生患者和正常人外周血DD3均為陰性。相比較而言尿液中DD3的檢測標(biāo)本更容易獲得、更容易為患者接受。

本次研究發(fā)現(xiàn)，三類患者DD3mRNA的相對定量值有明顯差異，前列腺患者是前列腺良性增生患者的25.6倍，而前列腺良性增生患者是非前列腺疾病患者的1.8倍。各個Gleason評分/分化程度中，DD3相對定量值有明顯差異，分化程度越低（惡性程度越高），DD3相對定量值越高。在各個血清PSA水平級別之間，DD3相對定量值有差異。

因此，尿液DD3mRNA定量檢測可以替代血清中tPSA檢測成為前列腺癌篩查的檢查指標(biāo)。尿液DD3mRNA定量檢測聯(lián)合分子生物學(xué)技術(shù)在PC診治中具有重要的價值。