黃連不同方法提取物治療2型糖尿病大鼠的比較研究*

童鳳雪 張礫丹 鄒 欣 魏世超 胡茹楠 劉 謙 陸付耳 徐麗君△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢 4300302華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 4300303華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合系，武漢 430030

2型糖尿病歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，而黃連用于治療消渴已有2千余年歷史。丸劑是指藥材細(xì)粉或藥材提取物加適宜的黏合輔料制成的球形或類球形制劑，古人應(yīng)用黃連治療消渴多以粉末形式如丸劑入藥。東晉《肘后備急方》中單用黃連作蜜丸治消渴癥，宋代《神效方》中用酒蒸黃連丸治消渴之多飲、多尿、口渴易饑、發(fā)熱、瘦弱。課題組前期研究[1]表明，黃連粉末直接給藥較其相同劑量煎劑具有更好更穩(wěn)定的降糖效果。為了進(jìn)一步探究黃連粉末對(duì)2型糖尿病的治療效果，本研究分別采用超臨界萃取法和模擬胃液提取法提取黃連粉末，檢測(cè)其主要有效物質(zhì)組成，探討其降糖作用與其主要成分含量的相關(guān)性及相關(guān)治療機(jī)理。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

90只SPF級(jí)健康純種雄性Wistar大鼠，體重(200±10)g，購自維通利華有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

崩解儀(24CB10C，美國)，超聲臨界萃取儀(HA-221-40-11-C型，中國)，粉粹機(jī)(24CB10C，美國WARING公司)，高效液相色譜儀(1410 UV檢測(cè)器，日本HITACHI)，恒溫水浴鍋(Y14-VFP，英國)，制冰機(jī)(日本SANYO公司)，倒置顯微鏡(日本OLYPUS公司)，酶標(biāo)儀(09110056，美國Bio-Tek公司)，迷你離心機(jī)(LX-200，中國其林貝爾儀器)，漩渦混合器(XW-80A，中國滬西儀器)，恒溫箱(XMTD-8222，中國天康電子)，臺(tái)式高速離心機(jī)型(2-16K，德國的sigma公司)，血糖儀(Accu-ChekPerfoma，德國Roche公司)，電子天平(BT25S，中國賽多利斯)，微量加樣器(P1000、P200、P100、P20、P2.5，德國Eppendorf公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品

黃連由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定本品為毛茛科植物黃連RhizomaCoptidischinensisFranch的干燥根莖。阿魏酸、藥根堿、小檗堿、黃連堿、黃柏酮對(duì)照品均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度≥98%；巴馬丁對(duì)照品，購自大連美侖生物科技公司，純度≥95%。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

鹽酸二甲雙胍片(國藥準(zhǔn)字H20023371)購自中美上海施貴寶制藥有限公司。羅氏血糖試紙購自德國Roche公司。大鼠血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海邦亦生物科技公司。石蠟切片購自武漢谷歌生物公司。

1.4 藥物制備

1.4.1 黃連粉末制備 取黃連105℃干燥2 h，放入粉碎機(jī)中粉碎成過40～60目篩粉末，置于干燥器中備用。

1.4.2 模擬胃液制備 人工胃液配置方法為2 g NaCl、3.2 g胃蛋白酶溶于500 mL純凈水中，加入 7 mL 36.5%濃鹽酸，搖勻后，加純凈水定容至1 000 mL。

1.4.3 黃連超臨界萃取物 前期運(yùn)用了正交試驗(yàn)法，對(duì)黃連超臨界萃取的4個(gè)因素及對(duì)應(yīng)的3個(gè)水平按L9(34)進(jìn)行分組設(shè)計(jì)，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定出優(yōu)化萃取方案：上述黃連粉末200 g，CO230 L/h，萃取時(shí)間2 h，萃取分離溫度50℃，萃取壓力200 MPa，夾帶劑為90%乙醇300 mL。依據(jù)上述方法萃取黃連超臨界萃取物，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(69℃)中濃縮，制成粉末，備用。

1.4.4 黃連模擬胃液提取物 取上述黃連粉末200 g，分2次加入1 000 mL模擬胃液中，置于崩解儀中，溫度控制在(37±0.5)℃，第1次攪拌2 h，過濾，收集濾液，濾渣于前述條件下攪拌0.5 h，合并濾液。提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(69℃)中濃縮，制成粉末，備用。

1.4.5 黃連提取物指紋圖譜的建立及其代表性有效成分的含量測(cè)定 運(yùn)用高效液相色譜法，對(duì)黃連超臨界萃取物(A)和模擬胃液提取物(B)進(jìn)行指紋圖譜的建立和有效成分的定量研究。

色譜條件為1410 UV檢測(cè)器，XTerra C18色譜柱(4.6 cm×250 cm，0.5 um)，流動(dòng)相比例為20 mmol/L KH2PO4(含0.2% H3PO4)：CH3CN-H2O(含25 mmol/L SPB)=62：38，檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm，流速0.8 mL/min，柱溫36℃。

1.5 造模方法

90只大鼠，經(jīng)過1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)選出15只大鼠作為正常對(duì)照組(N組)，標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。其余大鼠以高脂飼料(67.5%的標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料+12%豬油+2%膽固醇+0.5%膽汁鹽+20%糖)喂養(yǎng)40 d后，將大鼠按24 mg/kg體重劑量尾靜脈注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)。以N組大鼠OGTT不同時(shí)間點(diǎn)血糖值的95%置信區(qū)間作為參照，若高脂飼料喂養(yǎng)大鼠在任意時(shí)間點(diǎn)的血糖均高于該置信區(qū)間上限的20%，則選擇該大鼠作為2型糖尿病大鼠的成功模型。

1.6 分組及給藥

制模成功后將糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(M組)、陽性對(duì)照組(D組)、黃連超臨界萃取物治療組(A組)和黃連模擬胃液提取物治療組(B組)共4組，每組各15只。

D組大鼠予以鹽酸二甲雙胍片184 mg/(kg·d)灌胃；A組大鼠予以黃連超臨界萃取物88 mg/(kg·d)灌胃，B組大鼠予以黃連模擬胃液提取物333 mg/(kg·d)灌胃。所有藥物都溶解在1：1的油-水混合物中，每只大鼠的每日灌胃量為1 mL/100 g，胃灌注劑量每周根據(jù)大鼠的體重調(diào)整；所有小鼠均連續(xù)灌胃治療9周。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)

1.7.1 OGTT血糖水平檢測(cè) 連續(xù)灌胃治療9周后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行OGTT血糖檢測(cè)。檢測(cè)前一晚所有大鼠禁食8 h，第2 d清晨檢測(cè)空腹血糖(FBG)后，每只大鼠按2.5 g/kg體重劑量灌服50%葡萄糖液，尾靜脈取血，測(cè)量各組小鼠餐后1 h血糖(1 h PG)、餐后2 h血糖(2 hPG)水平。

1.7.2 體重、血清TG及IL-6水平檢測(cè) 連續(xù)灌胃治療9周后，各組大鼠稱體重(g)，按300 mg/kg體重劑量腹腔注射100 g/L水合氯醛進(jìn)行麻醉，行腹主靜脈采血，分裝、分離，收集血清，備用。用試劑盒測(cè)定血清TG水平。采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清IL-6水平，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠血清樣品中IL-6的含量。

1.7.3 腸道組織病理改變 各組大鼠經(jīng)上述處理，進(jìn)行麻醉、采血后，取各組大鼠腸道組織，用冰0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行沖洗，濾紙擦干多余水分后置于液氮中保存。將各組大鼠小腸組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中，室溫固定24 h以上，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋后切片。對(duì)制好的石蠟切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察各組大鼠小腸病理改變情況并拍攝照片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 相同劑量下代表性有效成分的含量

根據(jù)指紋圖譜結(jié)果，對(duì)其中6個(gè)峰進(jìn)行了指認(rèn)，分別為阿魏酸、藥根堿、黃連堿、巴馬丁、黃柏酮和小檗堿；通過每組測(cè)量4次，取平均值得出2種提取物相同劑量下各代表性有效成分的含量，黃連超臨界萃取物均高于黃連模擬胃液提取物。見表1。

2.2 有效劑量下代表性有效成分的含量

根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果顯示，黃連超臨界萃取物的大鼠有效劑量為88 mg/(kg·d)，黃連模擬胃液提取物的大鼠有效劑量為333 mg/(kg·d)，結(jié)合表1結(jié)果計(jì)算出2種提取物有效劑量下代表性有效成分的含量，黃連超臨界萃取物中僅小檗堿與巴馬丁的含量高于黃連模擬胃液提取物。見表2。

2.3 OGTT血糖水平比較

造模后，M組大鼠FBG、1 hPG、2 hPG血糖水平均明顯高于N組大鼠(P<0.05)；治療后，D組、A組、B組大鼠FBG、1 hPG、2 hPG水平均明顯低于M組大鼠(P<0.05)；A組與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 體重、血清TG及IL-6水平比較

造模后，M組大鼠體重、血清TG及IL-6水平均明顯高于N組大鼠(P<0.05)；治療后，D組、A組、B組大鼠體重、血清TG及IL-6水平均明顯低于M組大鼠(P<0.05)；A組與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

2.5 腸道組織病理改變比較

光鏡下，N組大鼠小腸組織基膜連續(xù)性完好，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，絨毛完整，其中杯狀細(xì)胞、炎性細(xì)胞及空泡較少；M組大鼠小腸組織基膜連續(xù)性較N組明顯缺失，絨毛有斷裂，杯狀細(xì)胞、炎性細(xì)胞及空泡較N組明顯增加；D組、A組、B組大鼠小腸組織基膜連續(xù)性可，缺失程度較M組顯著改善，杯狀細(xì)胞、炎性細(xì)胞及空泡數(shù)量顯著減少。見圖1。

表1 2種提取物相同劑量下代表性有效成分的含量(n=4，mg/g)

表2 黃連不同方法提取物的大鼠有效劑量中各代表成分的含量(n=4，mg/g)

表3 各組大鼠OGTT血糖水平比較

與N組比較，*P<0.05；與M組比較，△P<0.05

表4 各組大鼠體重、血清TG及IL-6水平比較

與N組比較，*P<0.05；與M組比較，△P<0.05

圖1 各組大鼠腸道組織石蠟切片HE染色圖片(×400)

3 討論

黃連是迄今臨床上治療糖尿病最常用的中藥之一，其有效成分如小檗堿、黃連堿、藥根堿等均具有一定的降糖調(diào)脂功效[2-3]。古方中，黃連多以粉末入丸劑來治療糖尿病，本課題組前期研究也證實(shí)，含等劑量小檗堿的黃連粉末和黃連煎劑用以治療糖尿病，黃連粉末的療效更穩(wěn)定、起效時(shí)間更快。如何高效提取黃連中的有效成分成為了一個(gè)重要問題。

本研究特設(shè)計(jì)無水提取方法——超臨界萃取，其特點(diǎn)完全不同于我們傳統(tǒng)意義上的水煎和有機(jī)溶劑提取，其萃取液即超臨界流體，似液體的密度且介電常數(shù)同極性有機(jī)溶劑，對(duì)化合物的溶劑化能力增強(qiáng)；似氣體的傳遞性質(zhì)和零表面張力，可進(jìn)入到任何大于超臨界流體分子的空間[4]，如CO2；夾帶劑的合理運(yùn)用可以有效提高中藥中有效成分的提取效率[5]，例如乙醇顯示出超凡的溶解物質(zhì)能力，使得被提取物質(zhì)的性質(zhì)范圍更廣。超臨界萃取條件接近室溫(35～40℃)，有效防止了熱敏性物質(zhì)的氧化和逸散；CO2為惰性介質(zhì)，萃取過程中不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，杜絕了黃連中生物堿和阿魏酸在進(jìn)行水煎煮過程中的酸堿中和反應(yīng)，可以最大限度地保證目標(biāo)效應(yīng)物質(zhì)不被破壞、中和或沉淀。為了描述黃連以粉末灌服條件下，其有效成分在胃液中的溶出特征，本研究特采用崩解儀提取模擬胃液，并進(jìn)行指紋圖譜分析，分析黃連模擬胃液提取物中代表性有效成分的含量及比例，為黃連降糖調(diào)脂功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，并以此提取物直接灌胃，代替粉末口服給藥。

越來越多的研究[6]表明2型糖尿病作為一種自然免疫和慢性亞臨床炎癥疾病，有多種炎癥因子參與其中，其中包括IL-6。2型糖尿病患者的血清IL-6水平明顯升高，更有研究提出IL-6的異常增高在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。糖尿病患者多有組織慢性炎癥改變，已有研究[7]顯示糖尿病腸道基膜炎性改變對(duì)于疾病發(fā)展的重要性更值得關(guān)注。

本研究結(jié)果顯示，2種提取物在相同劑量時(shí)，黃連超臨界萃取物中各代表性有效成分的含量均高于黃連模擬胃液提取物；2種提取物在有效劑量時(shí)，黃連超臨界萃取物中僅小檗堿與巴馬丁的含量高于黃連模擬胃液提取物；結(jié)果表明，在使用同等劑量黃連的情況下，黃連超臨界萃取物在經(jīng)濟(jì)性方面優(yōu)于黃連模擬胃液提取物。治療后，D組、A組、B組大鼠OGTT血糖水平、體重、血清TG及IL-6水平均明顯低于M組大鼠；A組與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組、A組、B組大鼠腸道組織病理情況較M組大鼠顯著改善；結(jié)果表明，黃連超臨界萃取物及黃連模擬胃液提取物都對(duì)2型糖尿病有一定療效且差異不大。本研究中黃連超臨界萃取物和黃連模擬胃液提取物所用劑量是前期研究篩選出的有效劑量，均表現(xiàn)出了良好的降糖調(diào)脂效果，其機(jī)理可能與炎癥相關(guān)，主要表現(xiàn)在炎性細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)降低及小腸組織基膜的炎性改變減少。

綜上所述，黃連超臨界萃取物及黃連模擬胃液提取物均對(duì)2型糖尿病大鼠具有一定治療作用，其主要成分含量與其療效無相關(guān)性，治療機(jī)制可能與改善腸道慢性炎癥有一定的關(guān)系。黃連超臨界萃取物中各代表性有效成分的含量與比例是目前具有降糖調(diào)脂作用的一個(gè)比較理想的組合，值得更進(jìn)一步的驗(yàn)證與研究。