川芎標準湯劑制備及質(zhì)量標準研究

馮玉 甄亞欽 田偉 范帥帥 李軍山

摘要：目的? 制備川芎飲片標準湯劑，測定川芎標準湯劑中阿魏酸的含量，并建立特征圖譜以進行質(zhì)量標準研究。方法? 依照標準湯劑的制備要求，制備15批不同產(chǎn)地的川芎飲片標準湯劑。以阿魏酸作為定量檢測指標，計算轉移率與出膏率，并建立超高液相色譜特征圖譜，用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件進行特征圖譜分析。結果? 15批川芎標準湯劑的出膏率范圍為5.4%～10.1%;阿魏酸含量范圍為2.39～4.44 mg/g，轉移率范圍為9.28%～17.24%。川芎標準湯劑特征圖譜共標定了10個共有峰，指認其中4個共有峰。15批川芎飲片標準湯劑相似度均大于0.90。結論? 川芎飲片標準湯劑制備規(guī)范，測定方法精密度、穩(wěn)定性和重復性良好，可為川芎配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

關鍵詞：川芎;標準湯劑;配方顆粒;轉移率;出膏率;特征圖譜

中圖分類號：R284.1? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2019）04-0068-06

川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，味辛，性溫，歸肝、膽、心包經(jīng)，具有活血行氣、祛風止痛功效[1]，主產(chǎn)于四川彭州、眉山、都江堰等地[2-3]。川芎含有苯酞類、萜烯類、有機酸及其酯、生物堿、多糖等多種類型的化學成分[4-5]，其中苯酞類化合物主要有藁本內(nèi)酯、丁基酞內(nèi)酯、丁烯基酞內(nèi)酯等，萜烯類主要有6-丁基-1，4-環(huán)庚二烯、桉葉二烯、松油烯等，有機酸及其酯類主要有阿魏酸、咖啡酸、芥子酸、琥珀酸等，生物堿類主要有川芎嗪、黑麥堿、三甲胺、腺嘌呤等[4，6]。阿魏酸、川芎嗪是川芎的主要有效成分[4]。川芎具有使離體及在體心臟收縮振幅增大、減慢心率、擴張冠脈血管、增加冠脈流量、舒張外周動脈血管、改善腦循環(huán)、保護腦缺血損傷、抑制血小板聚集、抗血栓形成、解除平滑肌痙攣、增強記憶、抗氧化等藥理作用[7-8]。

中藥配方顆粒在服用、攜帶、貯藏、運輸、調(diào)劑等方面較傳統(tǒng)中藥飲片有明顯優(yōu)勢，已廣泛應用于臨床各科并初步顯示出較好的臨床療效。作為中藥新劑型，配方顆粒既可滿足中醫(yī)隨證加減需要，又為需服中藥但不方便煎煮的患者提供了一條便利途徑，與中藥飲片互為補充，呈現(xiàn)出良好的發(fā)展趨勢[9]。盡管如此，中藥配方顆粒與傳統(tǒng)中藥飲片煎劑療效是否相等仍是目前關注的核心問題[10]。中藥飲片標準湯劑是以中醫(yī)理論為指導、臨床應用為基礎，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑，用于標化臨床用藥，保障用藥的準確性和劑量的一致性。中藥飲片標準湯劑綜合體現(xiàn)了飲片和制備工藝等影響療效的關鍵因素[11]。中藥飲片標準湯劑能夠作為一種標準，標化不同的臨床用藥形式，提高用藥的準確性和劑量的一致性[12-13]。中藥配方顆粒的生產(chǎn)工藝參數(shù)確定、質(zhì)量控制方法和指標選擇、限度制定等藥學研究，均須與標準湯劑進行對比，以保證其質(zhì)量。本研究遵循標準湯劑制備方法，選用主產(chǎn)區(qū)15批川芎飲片，制備標準湯劑，以阿魏酸為指標成分，測定其含量，計算轉移率和出膏率范圍，并進行特征圖譜研究，為川芎飲片標準湯劑質(zhì)量標準的制定提供基礎研究數(shù)據(jù)，同時提高川芎配方顆粒的質(zhì)量控制水平。

1? 儀器與試藥

ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)（PDA檢測器），美國沃特世公司;Empower3色譜工作站，美國沃特世公司;LC-15C高效液相色譜儀（SPD-15C型紫外檢測器、SIL-10AF自動進樣器、CTO-15C柱溫箱），日本島津公司;Pilot5-8L真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;TB-215D、BSA224S-CW電子分析天平，北京賽多利斯;JY10001型電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司;KQ-250型超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司;RE-3000型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;BJH-W200F型陶瓷自動中藥煲（電源220 V、50 Hz，功率300 W，容量3.0 L），廣東天際電器股份有限公司。

阿魏酸對照品（批號110773-201313，純度98.8%）、咖啡酸對照品（批號110885-200102）、藁本內(nèi)酯對照品（批號111737-201608），中國食品藥品檢定研究院;綠原酸對照品（批號PY20170216），南京普怡生物科技有限公司;甲醇為色譜純（美國Fisher），乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。15批川芎飲片由神威藥業(yè)集團有限公司提供，經(jīng)檢驗均符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，樣品來源見表1。

2? 方法與結果

2.1? 標準湯劑的制備

取川芎飲片100 g，煎煮2次。一煎加9倍水，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min;二煎加7倍水，武火煮沸，文火保持微沸20 min。趁熱用200目篩網(wǎng)過濾，合并2次煎液，迅速冷卻，55 ℃真空減壓濃縮至200 mL左右，將濃縮液置于培養(yǎng)皿，-40 ℃凍存24 h后冷凍干燥，即得標準湯劑干粉。

2.2? 阿魏酸含量測定

2.2.1? 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-1%冰醋酸溶液（30∶70）為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長321 nm。色譜圖見圖1。

2.2.2? 對照品溶液的制備

精密稱取阿魏酸對照品10.05 mg（以98.8%計），置10 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得阿魏酸對照品貯備液;精密吸取貯備液0.2 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.019 9 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3? 供試品溶液的制備

取川芎干粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4? 方法學考察

2.2.4.1? 線性關系考察

精密吸取對照品溶液2、4、8、12、16、20 ?L，按“2.2.1”項下色譜條件測定，以阿魏酸進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=4.982 2×106X-1.274 7×104，r=0.999 9，結果表明，阿魏酸進樣量在0.039 8～0.398 0 ?g范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.4.2? 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 ?L，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，結果峰面積RSD=0.19%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3? 穩(wěn)定性試驗

取川芎干粉（批號1705102）約0.1 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取該供試品溶液10 ?L，按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、20、30 h進樣測定，結果阿魏酸峰面積RSD=0.75%，表明供試品溶液在30 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.4.4? 重復性試驗

取同一批川芎干粉（批號1705102）6份，每份約0.1 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 ?L，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，計算得同一批川芎干粉測得的阿魏酸含量均值為3.44 mg/g，RSD=0.60%，表明本方法的重復性良好。

2.2.4.5? 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批川芎干粉（批號1705102）9份，每份約0.05 g，精密稱定，精密加入相當于樣品含有量80%、100%、120%的阿魏酸對照品，每個水平平行3份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，每份平行測定2次，計算得阿魏酸的平均回收率為103.13%，RSD=1.12%，表明本方法準確度良好。

2.2.5? 樣品測定

按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0800項下水分測定法第二法測定15批川芎標準湯劑干粉的水分。取每批干粉各約2 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，開啟瓶蓋，在105 ℃干燥5 h，將瓶蓋蓋好，轉移至干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱定質(zhì)量，至連續(xù)2次稱量的差異不超過5 mg為止，根據(jù)減失的質(zhì)量計算水分含量（%）。根據(jù)干粉質(zhì)量計算出膏率，并按上述確定的含量測定條件對15批川芎標準湯劑進行測定，計算阿魏酸轉移率。結果見表2。以均值上下浮動30%規(guī)定出膏率和轉移率，則出膏率為5.4%～10.1%，阿魏酸轉移率為9.28%～17.24%。

2.3? 特征圖譜

2.3.1? 色譜條件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m）;流動相A為乙腈，B為0.1%磷酸，梯度洗脫（見表3）;流速：0.3 mL/min;檢測波長：276 nm;柱溫：35 ℃;進樣量：2 ?L。在此色譜條件下，各色譜峰與相鄰峰的分離度良好，峰形對稱。供試品和混合對照品色譜圖見圖2。

2.3.2? 混合對照品溶液的制備

取綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、藁本內(nèi)酯對照品適量，加70%甲醇配制成每1 mL含綠原酸0.041 mg、咖啡酸0.012 mg、阿魏酸0.019 mg、藁本內(nèi)酯0.038 mg的混合對照品溶液。

2.3.3? 供試品溶液的制備

取川芎干粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4? 方法學考察

2.3.4.1? 精密度試驗

取同一批川芎干粉（批號1705102）約0.1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液2 ?L，連續(xù)進樣6次，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果顯示兩者的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2? 穩(wěn)定性試驗

取同一批川芎干粉（批號1705102）約0.1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液2 ?L，分別在0、1、2、4、6、8、10 h進樣，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果表明兩者的RSD均小于3%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.3? 重復性考察

取同一批川芎干粉（批號1705102）6份，每份約0.1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液2 ?L，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果表明兩者的RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.3.5? 主成分分析與聚類分析

以10個共有峰峰面積為變量，采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，對15批川芎標準湯劑指紋圖譜進行主成分與聚類分析，計算成分特征值、貢獻率及累計貢獻率，前4個主成分的累計貢獻率為87.972%，可以反映15批川芎標準湯劑的質(zhì)量。計算15批川芎標準湯劑的主成分得分，得到15批樣品主成分得分三維圖及聚類分析結果，見表4、圖3、圖4。分析結果表明，主成分分析與聚類分析結果一致，編號為10的樣品與其他樣品較離散，其他樣品較為集中，表明15批川芎標準湯劑質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

2.3.6? 特征圖譜的建立及相似度評價

按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件，測定15批川芎標準湯劑特征圖譜，結果見圖5。運用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件，采用中位數(shù)法計算15批川芎標準湯劑相似度，結果見表5。川芎標準湯劑特征圖譜中確定了10個共有峰，根據(jù)色譜峰匹配結果進行相似度分析，各批次川芎標準湯劑與共有模式對照指紋圖譜相似度分別為0.998、0.996、0.997、0.994、0.986、0.996、0.991、0.984、0.966、0.947、0.999、0.998、0.996、0.993、0.997，均大于0.90，符合指紋圖譜相似度要求。選取阿魏酸色譜峰（5號峰）作為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.58%，各峰相對峰面積RSD介于18.01%～37.81%。結合主成分分析與聚類分析結果，表明15批川芎標準煎液質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

3? 討論

根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術要求（送審稿）》中第四部分標準湯劑要求：標準湯劑的制備包括煎煮、固液分離、濃縮和干燥等步驟，應固定方法、設備、工藝參數(shù)和操作規(guī)程。本研究對川芎標準湯劑的制備工藝進行了吸水率、加水量、煎煮時間、篩網(wǎng)目數(shù)、水煎液靜置時間的單因素考察，以標準湯劑的出膏率和阿魏酸含量為衡量指標，最終確定標準湯劑的制備工藝為“2.1”項下方法。本研究還對川芎標準湯劑干粉不同的提取方法（超聲提取及回流提取）進行了試驗比較，并對不同濃度的提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、純甲醇）及不同提取時間（10、20、30 min）進行了試驗篩選，結果確定為用70%甲醇超聲提取10 min。

中藥化學成分復雜，基原品種、產(chǎn)地來源、生長環(huán)境、采收季節(jié)、加工炮制工藝等諸多因素進一步增加了中藥質(zhì)量控制與評價研究的難度，僅憑傳統(tǒng)的外觀鑒別、顯微鑒別及少數(shù)有效成分分析鑒定中藥存在一定的不準確性[14]。近年來，超高效液相色譜指紋圖譜技術在中藥質(zhì)量評價中顯示出獨特的優(yōu)勢。中藥及其制劑以其整體發(fā)揮作用，中藥指紋圖譜能全面反映中藥內(nèi)在化學成分的種類與數(shù)量。目前中藥的有效成分尚未完全明確，采用中藥指紋圖譜方式能有效表征中藥質(zhì)量[15]。本試驗采用DAD檢測器進行全波長監(jiān)測，結果顯示，在波長276 nm處基線較平穩(wěn)，檢出峰各峰比例適中，能基本反映川芎飲標準湯劑中多成分的整體面貌，故選擇以276 nm作為檢測波長，同時對流動相梯度條件進行了考察，確定了流動相梯度洗脫條件。15批川芎標準湯劑的特征圖譜共標定了10個共有峰，指認出其中4個共有峰。15批川芎標準湯劑的特征圖譜相似度均大于0.90，并結合主成分分析與聚類分析，表明15批川芎標準湯劑的質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

中藥配方顆粒最核心的問題是建立質(zhì)量標準，運用現(xiàn)代科學方法對配方顆粒中指標性成分進行鑒別和含量測定。本試驗對川芎標準湯劑進行了出膏率、轉移率、阿魏酸含量測定及特征圖譜研究，并進行了方法學考察，其精密度、穩(wěn)定性、重復性的RSD均小于3%，表明此方法準確、可行、重復性良好，可用于川芎飲片及配方顆粒的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2018-06-27）

（修回日期：2018-07-16;編輯：陳靜）