高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法HPLC-MS/MS測定CRRT時(shí)血漿哌拉西林/他唑巴坦?jié)舛?/h1>
2019-04-25 00:32:22蔡云徐麗
中國現(xiàn)代醫(yī)生 2019年5期
蔡云 徐麗
[摘要] 目的 建立準(zhǔn)確、靈敏的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）測定持續(xù)腎臟替代（continuous renal replacement， CRRT）時(shí)人血漿中哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉的濃度。 方法 選用高、低兩種劑量給藥，采取單制劑雙周期序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對12例行CRRT患者完成哌拉西林/他唑巴坦鈉靜脈滴注之后，使用HPLC-MS/MS方法同時(shí)測定哌拉西林及他唑巴坦的濃度。采用Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱;流動相為甲醇：乙腈：水：1 mol/L 氨水：甲酸（25∶15∶60∶0.1∶0.05），質(zhì)譜檢測采用電噴霧離子源，多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）模式檢測。 結(jié)果 血漿中哌拉西林線性范圍為1～100 mg/L，他唑巴坦線性范圍為0.5～40.0 mg/L，高、中、低3個濃度日內(nèi)及日間精密度均小于5%。實(shí)測12例行CRRT患者，血藥濃度與給藥劑量呈相關(guān)性。 結(jié)論 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高、特異性好，可以運(yùn)用于膿毒癥患者接受CRRT時(shí)血漿哌拉西林/他唑巴坦?jié)舛鹊臏y定。
[關(guān)鍵詞] 哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉;持續(xù)腎臟替代治療;高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法;藥動學(xué)
[中圖分類號] R969? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）05-0037-05
[Abstract] Objective To establish an accurate and sensitive high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS/MS） for the determination of piperacillin in human plasma the concentration of sodium/tazobactam sodium during continuous renal replacement（CRRT）. Methods The high-dose and low-dose two-dose method were used to design a single-dose two-cycle sequential test. After 12 patients with CRRT were treated with piperacillin/tazobactam sodium intravenously， HPLC-MS/MS was used simultaneously to determine the concentrations of piperacillin and tazobactam. The Gemini C18（50 mm×3.0 mm， 3 μm） analytical column was used. The mobile phase was methanol， acetonitrile， water， 1 mol/L ammonia， formic acid（25：15：60：0.1：0.05）. Mass spectrometry was detected using an electrospray ion source and multiple reactive ion monitoring（MRM） mode. Results The linear range of piperacillin in plasma was 1-100 mg/L， and the linear range of tazobactam was 0.5～40.0 mg/L. The intra-day and inter-day precision of high， medium and low concentrations were less than 5%. The blood concentration of 12 patients who underwent CRRT was correlated with the dose. Conclusion High performance liquid chromatography-mass spectrometry has high sensitivity and specificity， and can be used to determine the plasma concentration of piperacillin/tazobactam in patients with sepsis receiving CRRT.
[Key words] Piperacillin sodium/tazobactam sodium; Continuous renal replacement therapy; High performance liquid chromatography-mass spectrometry（HPLC-MS/MS）; Pharmacokinetics
哌拉西林/他唑巴坦屬于β-內(nèi)酰胺/內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑，對于許多革蘭陽性和革蘭陰性的需氧菌及厭氧菌具有抗菌活性，臨床廣泛應(yīng)用于肺部、皮膚軟組織、腹腔、泌尿道等感染的膿毒癥患者[1]。但當(dāng)患者進(jìn)行CRRT時(shí)使用哌拉西林/他唑巴坦，其藥代動力學(xué)可能會受到較大影響[2]。在CRRT過程中進(jìn)行哌拉西林他唑巴坦的血藥濃度監(jiān)測可以幫助臨床醫(yī)生選擇更加合理的給藥方式。目前國內(nèi)大多采用高效液相色譜法測定生物標(biāo)本中哌拉西林及他唑巴坦的濃度，耗時(shí)長、檢測限高;本研究旨在構(gòu)建一種更高效、準(zhǔn)確地測定哌拉西林、他唑巴坦?jié)舛鹊母咝б合嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）方法，為該藥物在CRRT時(shí)的藥代動力學(xué)研究提供理論支撐，現(xiàn)報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
PRISMA連續(xù)性血液凈化儀，Prisma M100 Pre Set管路及濾器，Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱（上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司）;哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉[1.25 g（4∶1）/支，批號：0512461，華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司生產(chǎn)]。哌拉西林標(biāo)準(zhǔn)品100 mg（中國食品藥品檢定研究院，批號：130419-201205），他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130511-201303），乙腈（色譜純）（美國天地有限公司）、磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）及甲醇（色譜純，美國天地有限公司）。
1.2方法
采用PRISMA連續(xù)性血液凈化儀，濾器采用配套的Prisma M100 Pre Set管路及濾器（面積0.9 m2，AN69HF空心纖維），置換液前稀釋法輸入;模式統(tǒng)一采用持續(xù)靜脈-靜脈血液濾過（continuous veno venous hemofiltration，CVVH），置換液流速2000 mL/h，血流速120～150 mL/min。精密稱取哌拉西林標(biāo)準(zhǔn)品95 mg，采用濃度45%甲醇將其溶解，而后將其定容，配置成相應(yīng)儲備液，即10 g/L;精密稱取他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，方法同上，配置成1 g/L儲備液。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
采用Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱;流動相為甲醇∶乙腈∶水∶1 mol/L 氨水：甲酸（25∶15∶60∶0.1∶0.05），流速為0.23 mL/min，柱溫為40℃。質(zhì)譜檢測采用電噴霧離子源，多反應(yīng)離子監(jiān)測模式檢測，噴霧電壓為5000 V，干燥氣流速為7 L/min，溫度為450℃，碰撞氣為7 psi，霧化氣為8 psi，氣簾氣為7 psi;離子去簇電壓20 V;環(huán)形聚焦電壓57 V;SHA、M2（兩種特用符號）和內(nèi)標(biāo)d5-SHA 監(jiān)測離子對m/z分別為265.2/232.2、194.1/176.1和 270.3/237.3，碰撞室射出電壓分別為5、9和5 V，碰撞誘導(dǎo)解離電壓分別為17、16和18 V，入口電壓分別為7、5和7 V。
2.2 血漿樣品處理
（1）處理哌拉西林鈉血漿樣品。將血漿樣品0.24 mL加入Eppendorf管（錐形帶蓋塑料管）內(nèi)（1.5 mL），而后加入水10 μL，另加入甲醇0.70 mL，將其均勻搖晃之后（1 min），以10000 r/min的速率進(jìn)行離心，時(shí)間控制在4 min，將清液取出（10 μL），以此分析HPLC。（2）他唑巴坦鈉血漿樣品處理。于錐形帶蓋塑料管內(nèi)（1.5 mL），加入血漿樣品0.24 mL，而后加入水10 μL，然后加入乙腈0.24 mL，將其均勻搖晃之后（1 min），采用10000 r/min離心，時(shí)間控制在1 min，將清液取出（20 μL），以此作為HPLC實(shí)施分析。
2.3 血漿中他唑巴坦鈉及哌拉西林鈉相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備
（1）哌拉西林鈉。將若干份空白血漿取出，0.25 mL/份，將濃度各異的哌拉西林溶液（10 μL）分別加入，配置6個血漿樣品，其質(zhì)量濃度分別為200、100、50、25、5和1 mg/L，依據(jù)上文血漿樣品的處理操作，記錄色譜圖，橫坐標(biāo)表示樣品濃度，縱坐標(biāo)表示色譜峰面積值，便可得出加權(quán)回歸方程，即為r=0.9946，Y=-2846+23458.57X;其質(zhì)量濃度區(qū)間為1～190 mg/L（S/N>10）。（2）他唑巴坦鈉。將若干份空白血漿取出，0.25 mL/份，將濃度各異的他唑巴坦溶液（10 μL）分別加入，配置6個血漿樣品，其質(zhì)量濃度分別為40、20、10、5、2.5和0.5 mg/L，將色譜圖予以記錄，橫坐標(biāo)表示樣品濃度，縱坐標(biāo)表示色譜峰面積值，便可得出加權(quán)回歸方程，即為r=0.9942，Y=-8611+13498.5X;其質(zhì)量濃度區(qū)間為0.5～40.0 mg/L（S/N>10）。
2.4樣品絕對回收率試驗(yàn)
（1）哌拉西林鈉。先取0.25 mL空白血漿，依據(jù)2.3操作流程配置3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣，即為高、中、低，各濃度均為5份，依據(jù)2.2相應(yīng)處理流程，對色譜圖予以記錄。此外，取上述3個濃度的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣，不對其給予處理，采用流動相，將其容積設(shè)定為相同體積，實(shí)施進(jìn)樣處理，并對其色譜圖予以記錄[3]。通過峰面積比，對絕對回收率進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式：回收率（%）=（加標(biāo)樣品測定值-樣品測定值×加標(biāo)樣品中測定液體的比例）/加標(biāo)量×100%。最終結(jié)果可知，2.5 mg/L質(zhì)量濃度回收率為（80.1±5.2）%，RSD為6.6%;50.0 mg/L為（89.0±1.9）%，RSD為2.1%;160.0 mg/L為（87.1±1.1）%，其RSD為1.3%。（2）他唑巴坦鈉。操作方法同上，最終結(jié)果可知，1.0 mg/L質(zhì)量濃度回收率為（83.8±1.5）%，RSD為1.8%;10.0 mg/L為（86.0±2.3）%，RSD為2.6%;30.0 mg/L為（94.1±1.5）%，其RSD為1.6%。
2.5 方法的準(zhǔn)確度與精密度
（1）哌拉西林鈉。先取0.25 mL空白血漿，依據(jù)2.3操作流程配置3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣，即為高、中、低，各濃度均為5份，依據(jù)2.2相應(yīng)處理流程，對樣品峰面積比值及面積予以記錄，將其代至同條工作曲線，將濃度算出，并將其當(dāng)作相應(yīng)精密度指標(biāo);最終的相對回收率=計(jì)算所得出的濃度/加入濃度[4-7]。最終結(jié)果表明，2.5 mg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿日內(nèi)RSD為1.1%，日間RSD為2.0%，平均回收率為（99.4±1.4）%;50.0 mg/L為3.9%，日間RSD為3.3%，平均回收率為（99.7±2.9）%;160.0 mg/L為2.7%，日間RSD為2.4%，平均回收率為（105.5±3.0）%。（2）他唑巴坦鈉。操作流程同上，最終結(jié)果可知，1.0 mg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿日內(nèi)RSD為1.6%，日間RSD為2.7%，平均回收率為（99.0±2.0）%;10.0 mg/L1為2.6%，日間RSD為2.1%，平均回收率為（99.6±2.2）%;30.0 mg/L為1.6%，日間RSD為3.0%，平均回收率為（100.3±1.5）%。
2.6 血漿樣品凍融穩(wěn)定性
先取0.25 mL空白血漿，依據(jù)2.3操作流程配置3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣，即為高、中、低，將其放置于溫度為-20℃的環(huán)境中，保存時(shí)間為3～5 d，然后將其取出，依據(jù)2.2相關(guān)操作實(shí)施處理，經(jīng)哌拉西林鈉濃度予以測定;另外，對其中三份樣本實(shí)施反復(fù)的凍融操作，次數(shù)不少于3次，而后將其哌拉西林鈉濃度給予再次測定。最終結(jié)果可知，在溫度為-20 ℃環(huán)境中所保存的血漿，在保存的3 d時(shí)間內(nèi)，哌拉西林鈉濃度在下降幅度方面均小于10%，而在6 d之內(nèi)，其存在有大于10%的變化趨勢。至此可知，在實(shí)施分次采集血樣操作過程中，需在4 d之內(nèi)將其完成測定工作，并將其放置于相位室溫環(huán)境中，其在3 h內(nèi)在變化方面不會大于10%，而若超過6 h，則其下降就會大于15%，所以，需在3 h內(nèi)完成樣品的測定處理工作，將其放置凍融環(huán)境中，具有良好的穩(wěn)定性。（2）他唑巴坦鈉。方法同上，完成2.2項(xiàng)操作之后，對他唑巴坦鈉濃度進(jìn)行測定;另外，對其中三份樣本實(shí)施反復(fù)的凍融操作，次數(shù)不少于3次，而后將其他唑巴坦鈉濃度給予再次測定。最終結(jié)果可知，在溫度為-20℃環(huán)境中所保存的血漿，在保存的3 d時(shí)間內(nèi)，他唑巴坦鈉濃度在下降幅度方面均小于10%，而在5 d之內(nèi)，其存在有大于10%的變化趨勢。至此可知，在實(shí)施分次采集血樣操作過程中，需在3 d之內(nèi)將其完成測定工作，當(dāng)完成他唑巴坦鈉血漿樣品通過蛋白沉淀處理操作之后，所得到的溶液放置室溫中，其在3 h內(nèi)在變化方面不會大于10%，而若超過7 h，則其下降會>15%，所以，需在3 h內(nèi)完成樣品的測定處理工作。
2.7 患者標(biāo)準(zhǔn)
接受CRRT的患者，同時(shí)符合：（1）年齡：18～70歲;（2）無青霉素過敏史且青霉素皮試陰性;（3）既往無慢性肝、腎功能不全病史;（4）行CRRT前1周內(nèi)未使用過含哌拉西林及他唑巴坦成分的藥物;（5）臨床判斷單用或聯(lián)用哌拉西林/他唑巴坦可以有效覆蓋可能致病菌;（6）本人或授權(quán)人書面同意接受本研究。
2.8 哌拉西林鈉他唑巴坦鈉人體藥動學(xué)
（1）哌拉西林鈉。單次試驗(yàn)1：選取12例符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者，對試劑實(shí)施靜脈滴注，即哌拉西林/他唑巴坦（1 g/0.25 g）/次，采用生理鹽水100 mL溶解，對滴速予以嚴(yán)格控制，恒速運(yùn)行，滴注時(shí)間為30 min。各受試者于實(shí)施靜脈滴注前，以及開始滴注之后5、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min分別抽取5 mL外周靜脈血。血樣經(jīng)10 min、3000 r/min離心后取上清液2 mL，-80℃保存，等待檢測。單次試驗(yàn)2：所選取12例嚴(yán)重膿毒癥受試者在單次實(shí)驗(yàn)1以后48 h后，再次對試劑實(shí)施靜脈滴注，即哌拉西林/他唑巴坦（2 g/0.5 g）/次，方法同上。
2.9 方法的專屬性
（1）哌拉西林鈉。選取6例嚴(yán)重膿毒癥受試者，取其0.25 mL空白血漿;依據(jù)2.2項(xiàng)相關(guān)操作，實(shí)施15 μL進(jìn)樣，對色譜圖予以記錄;在空白血漿中，將哌拉西林鈉溶液放置其中依據(jù)相同方法，便可得出色譜圖，保存時(shí)間控制在5 min;當(dāng)患者完成給藥滴注之后，取其血漿樣品，依據(jù)上述操作，得出色譜圖;然后對比各色譜圖，見圖1（A、B、C）所示。（2）他唑巴坦鈉。另取6例嚴(yán)重膿毒癥受試者，取其0.25 mL空白血漿;依據(jù)2.2項(xiàng)相關(guān)操作，實(shí)施15 μL進(jìn)樣，對色譜圖予以記錄;在空白血漿中，將他唑巴坦鈉溶液放置其中依據(jù)相同方法，便可得出色譜圖，保留時(shí)間8 min;當(dāng)患者完成給藥滴注之后，取其血漿樣品，依據(jù)上述操作，得出色譜圖;然后對比各色譜圖，圖1（D、E、F）所示。
2.10制劑給藥藥動學(xué)
所選取的12例嚴(yán)重膿毒癥受試者，當(dāng)其完成哌拉西林鈉他唑巴鈉30 min靜脈滴注后，其藥動學(xué)參數(shù)，見表1。
表1? ?哌拉西林鈉他唑巴鈉靜滴的藥動學(xué)參數(shù)
結(jié)果可知，哌拉西林鈉（1.0 g）完成30 min靜滴之后，其與哌拉西林鈉（2.0 g）完成靜滴之后的計(jì)量比為50.0%，二者之間的AUC0～6比為47%，Cmax為49%，在計(jì)量方面呈現(xiàn)相關(guān)性。而在完成靜脈滴注劑量為他唑巴坦鈉（0.50 g）與他唑巴坦鈉（0.25 g）的比值則為50%，二者之間的AUC0～6比為44%，Cmax為47%，在計(jì)量方面呈現(xiàn)相關(guān)性。
3討論
本次試驗(yàn)研究構(gòu)建的基于血漿的HPLC-MS/MS測定法，患者血漿當(dāng)中的雜質(zhì)，對樣品峰不造成干擾，基于此種試驗(yàn)環(huán)境下，其具有較好的重復(fù)性，特異性也較好，具有較高的靈敏度、精密度及回收率，在質(zhì)量控制方面也與相關(guān)要求相符，與生物樣品具體的分析要求也相符[8-12]。
國外研究表明，CRRT時(shí)幾乎所有抗菌藥物的藥代動力學(xué)都會發(fā)生改變，影響程度可能取決于藥物的分子量、分布容積、蛋白結(jié)合率、濾器的材質(zhì)、CRRT模式等等多種因素[13-20]。國內(nèi)范珠[11]對健康志愿者的研究顯示靜滴哌拉西林/他唑巴坦（2 g/0.5 g）后Cmax分別為（152.7±23.8）mg/L和（32.8±5.8）mg/L，t1/2分別為（1.3±0.5）h和（0.95±0.18）h，與本研究實(shí)測結(jié)果有較大差異，初步證實(shí)了CRRT確實(shí)會對哌拉西林他唑巴坦的藥代學(xué)造成較大影響。本研究構(gòu)建的HPLC-MS/MS方法可以準(zhǔn)確、靈敏地檢測CRRT時(shí)哌拉西林他唑巴坦的血藥濃度，為臨床對接受CRRT的膿毒癥患者制定更加合理的給藥方案提供了一項(xiàng)切實(shí)可行的手段，有助于發(fā)揮哌拉西林/他唑巴坦的最大療效、改善患者的預(yù)后。
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（收稿日期：2018-06-27）
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蔡云 徐麗
[摘要] 目的 建立準(zhǔn)確、靈敏的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）測定持續(xù)腎臟替代（continuous renal replacement， CRRT）時(shí)人血漿中哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉的濃度。 方法 選用高、低兩種劑量給藥，采取單制劑雙周期序貫試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對12例行CRRT患者完成哌拉西林/他唑巴坦鈉靜脈滴注之后，使用HPLC-MS/MS方法同時(shí)測定哌拉西林及他唑巴坦的濃度。采用Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱;流動相為甲醇：乙腈：水：1 mol/L 氨水：甲酸（25∶15∶60∶0.1∶0.05），質(zhì)譜檢測采用電噴霧離子源，多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）模式檢測。 結(jié)果 血漿中哌拉西林線性范圍為1～100 mg/L，他唑巴坦線性范圍為0.5～40.0 mg/L，高、中、低3個濃度日內(nèi)及日間精密度均小于5%。實(shí)測12例行CRRT患者，血藥濃度與給藥劑量呈相關(guān)性。 結(jié)論 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高、特異性好，可以運(yùn)用于膿毒癥患者接受CRRT時(shí)血漿哌拉西林/他唑巴坦?jié)舛鹊臏y定。
[關(guān)鍵詞] 哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉;持續(xù)腎臟替代治療;高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法;藥動學(xué)
[中圖分類號] R969? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）05-0037-05
[Abstract] Objective To establish an accurate and sensitive high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS/MS） for the determination of piperacillin in human plasma the concentration of sodium/tazobactam sodium during continuous renal replacement（CRRT）. Methods The high-dose and low-dose two-dose method were used to design a single-dose two-cycle sequential test. After 12 patients with CRRT were treated with piperacillin/tazobactam sodium intravenously， HPLC-MS/MS was used simultaneously to determine the concentrations of piperacillin and tazobactam. The Gemini C18（50 mm×3.0 mm， 3 μm） analytical column was used. The mobile phase was methanol， acetonitrile， water， 1 mol/L ammonia， formic acid（25：15：60：0.1：0.05）. Mass spectrometry was detected using an electrospray ion source and multiple reactive ion monitoring（MRM） mode. Results The linear range of piperacillin in plasma was 1-100 mg/L， and the linear range of tazobactam was 0.5～40.0 mg/L. The intra-day and inter-day precision of high， medium and low concentrations were less than 5%. The blood concentration of 12 patients who underwent CRRT was correlated with the dose. Conclusion High performance liquid chromatography-mass spectrometry has high sensitivity and specificity， and can be used to determine the plasma concentration of piperacillin/tazobactam in patients with sepsis receiving CRRT.
[Key words] Piperacillin sodium/tazobactam sodium; Continuous renal replacement therapy; High performance liquid chromatography-mass spectrometry（HPLC-MS/MS）; Pharmacokinetics
哌拉西林/他唑巴坦屬于β-內(nèi)酰胺/內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑，對于許多革蘭陽性和革蘭陰性的需氧菌及厭氧菌具有抗菌活性，臨床廣泛應(yīng)用于肺部、皮膚軟組織、腹腔、泌尿道等感染的膿毒癥患者[1]。但當(dāng)患者進(jìn)行CRRT時(shí)使用哌拉西林/他唑巴坦，其藥代動力學(xué)可能會受到較大影響[2]。在CRRT過程中進(jìn)行哌拉西林他唑巴坦的血藥濃度監(jiān)測可以幫助臨床醫(yī)生選擇更加合理的給藥方式。目前國內(nèi)大多采用高效液相色譜法測定生物標(biāo)本中哌拉西林及他唑巴坦的濃度，耗時(shí)長、檢測限高;本研究旨在構(gòu)建一種更高效、準(zhǔn)確地測定哌拉西林、他唑巴坦?jié)舛鹊母咝б合嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）方法，為該藥物在CRRT時(shí)的藥代動力學(xué)研究提供理論支撐，現(xiàn)報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
PRISMA連續(xù)性血液凈化儀，Prisma M100 Pre Set管路及濾器，Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱（上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司）;哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉[1.25 g（4∶1）/支，批號：0512461，華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司生產(chǎn)]。哌拉西林標(biāo)準(zhǔn)品100 mg（中國食品藥品檢定研究院，批號：130419-201205），他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130511-201303），乙腈（色譜純）（美國天地有限公司）、磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）及甲醇（色譜純，美國天地有限公司）。
1.2方法
采用PRISMA連續(xù)性血液凈化儀，濾器采用配套的Prisma M100 Pre Set管路及濾器（面積0.9 m2，AN69HF空心纖維），置換液前稀釋法輸入;模式統(tǒng)一采用持續(xù)靜脈-靜脈血液濾過（continuous veno venous hemofiltration，CVVH），置換液流速2000 mL/h，血流速120～150 mL/min。精密稱取哌拉西林標(biāo)準(zhǔn)品95 mg，采用濃度45%甲醇將其溶解，而后將其定容，配置成相應(yīng)儲備液，即10 g/L;精密稱取他唑巴坦標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，方法同上，配置成1 g/L儲備液。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
采用Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱;流動相為甲醇∶乙腈∶水∶1 mol/L 氨水：甲酸（25∶15∶60∶0.1∶0.05），流速為0.23 mL/min，柱溫為40℃。質(zhì)譜檢測采用電噴霧離子源，多反應(yīng)離子監(jiān)測模式檢測，噴霧電壓為5000 V，干燥氣流速為7 L/min，溫度為450℃，碰撞氣為7 psi，霧化氣為8 psi，氣簾氣為7 psi;離子去簇電壓20 V;環(huán)形聚焦電壓57 V;SHA、M2（兩種特用符號）和內(nèi)標(biāo)d5-SHA 監(jiān)測離子對m/z分別為265.2/232.2、194.1/176.1和 270.3/237.3，碰撞室射出電壓分別為5、9和5 V，碰撞誘導(dǎo)解離電壓分別為17、16和18 V，入口電壓分別為7、5和7 V。
2.2 血漿樣品處理
（1）處理哌拉西林鈉血漿樣品。將血漿樣品0.24 mL加入Eppendorf管（錐形帶蓋塑料管）內(nèi)（1.5 mL），而后加入水10 μL，另加入甲醇0.70 mL，將其均勻搖晃之后（1 min），以10000 r/min的速率進(jìn)行離心，時(shí)間控制在4 min，將清液取出（10 μL），以此分析HPLC。（2）他唑巴坦鈉血漿樣品處理。于錐形帶蓋塑料管內(nèi)（1.5 mL），加入血漿樣品0.24 mL，而后加入水10 μL，然后加入乙腈0.24 mL，將其均勻搖晃之后（1 min），采用10000 r/min離心，時(shí)間控制在1 min，將清液取出（20 μL），以此作為HPLC實(shí)施分析。
2.3 血漿中他唑巴坦鈉及哌拉西林鈉相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備
（1）哌拉西林鈉。將若干份空白血漿取出，0.25 mL/份，將濃度各異的哌拉西林溶液（10 μL）分別加入，配置6個血漿樣品，其質(zhì)量濃度分別為200、100、50、25、5和1 mg/L，依據(jù)上文血漿樣品的處理操作，記錄色譜圖，橫坐標(biāo)表示樣品濃度，縱坐標(biāo)表示色譜峰面積值，便可得出加權(quán)回歸方程，即為r=0.9946，Y=-2846+23458.57X;其質(zhì)量濃度區(qū)間為1～190 mg/L（S/N>10）。（2）他唑巴坦鈉。將若干份空白血漿取出，0.25 mL/份，將濃度各異的他唑巴坦溶液（10 μL）分別加入，配置6個血漿樣品，其質(zhì)量濃度分別為40、20、10、5、2.5和0.5 mg/L，將色譜圖予以記錄，橫坐標(biāo)表示樣品濃度，縱坐標(biāo)表示色譜峰面積值，便可得出加權(quán)回歸方程，即為r=0.9942，Y=-8611+13498.5X;其質(zhì)量濃度區(qū)間為0.5～40.0 mg/L（S/N>10）。
2.4樣品絕對回收率試驗(yàn)
（1）哌拉西林鈉。先取0.25 mL空白血漿，依據(jù)2.3操作流程配置3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣，即為高、中、低，各濃度均為5份，依據(jù)2.2相應(yīng)處理流程，對色譜圖予以記錄。此外，取上述3個濃度的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣，不對其給予處理，采用流動相，將其容積設(shè)定為相同體積，實(shí)施進(jìn)樣處理，并對其色譜圖予以記錄[3]。通過峰面積比，對絕對回收率進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式：回收率（%）=（加標(biāo)樣品測定值-樣品測定值×加標(biāo)樣品中測定液體的比例）/加標(biāo)量×100%。最終結(jié)果可知，2.5 mg/L質(zhì)量濃度回收率為（80.1±5.2）%，RSD為6.6%;50.0 mg/L為（89.0±1.9）%，RSD為2.1%;160.0 mg/L為（87.1±1.1）%，其RSD為1.3%。（2）他唑巴坦鈉。操作方法同上，最終結(jié)果可知，1.0 mg/L質(zhì)量濃度回收率為（83.8±1.5）%，RSD為1.8%;10.0 mg/L為（86.0±2.3）%，RSD為2.6%;30.0 mg/L為（94.1±1.5）%，其RSD為1.6%。
2.5 方法的準(zhǔn)確度與精密度
（1）哌拉西林鈉。先取0.25 mL空白血漿，依據(jù)2.3操作流程配置3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣，即為高、中、低，各濃度均為5份，依據(jù)2.2相應(yīng)處理流程，對樣品峰面積比值及面積予以記錄，將其代至同條工作曲線，將濃度算出，并將其當(dāng)作相應(yīng)精密度指標(biāo);最終的相對回收率=計(jì)算所得出的濃度/加入濃度[4-7]。最終結(jié)果表明，2.5 mg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿日內(nèi)RSD為1.1%，日間RSD為2.0%，平均回收率為（99.4±1.4）%;50.0 mg/L為3.9%，日間RSD為3.3%，平均回收率為（99.7±2.9）%;160.0 mg/L為2.7%，日間RSD為2.4%，平均回收率為（105.5±3.0）%。（2）他唑巴坦鈉。操作流程同上，最終結(jié)果可知，1.0 mg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿日內(nèi)RSD為1.6%，日間RSD為2.7%，平均回收率為（99.0±2.0）%;10.0 mg/L1為2.6%，日間RSD為2.1%，平均回收率為（99.6±2.2）%;30.0 mg/L為1.6%，日間RSD為3.0%，平均回收率為（100.3±1.5）%。
2.6 血漿樣品凍融穩(wěn)定性
先取0.25 mL空白血漿，依據(jù)2.3操作流程配置3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣，即為高、中、低，將其放置于溫度為-20℃的環(huán)境中，保存時(shí)間為3～5 d，然后將其取出，依據(jù)2.2相關(guān)操作實(shí)施處理，經(jīng)哌拉西林鈉濃度予以測定;另外，對其中三份樣本實(shí)施反復(fù)的凍融操作，次數(shù)不少于3次，而后將其哌拉西林鈉濃度給予再次測定。最終結(jié)果可知，在溫度為-20 ℃環(huán)境中所保存的血漿，在保存的3 d時(shí)間內(nèi)，哌拉西林鈉濃度在下降幅度方面均小于10%，而在6 d之內(nèi)，其存在有大于10%的變化趨勢。至此可知，在實(shí)施分次采集血樣操作過程中，需在4 d之內(nèi)將其完成測定工作，并將其放置于相位室溫環(huán)境中，其在3 h內(nèi)在變化方面不會大于10%，而若超過6 h，則其下降就會大于15%，所以，需在3 h內(nèi)完成樣品的測定處理工作，將其放置凍融環(huán)境中，具有良好的穩(wěn)定性。（2）他唑巴坦鈉。方法同上，完成2.2項(xiàng)操作之后，對他唑巴坦鈉濃度進(jìn)行測定;另外，對其中三份樣本實(shí)施反復(fù)的凍融操作，次數(shù)不少于3次，而后將其他唑巴坦鈉濃度給予再次測定。最終結(jié)果可知，在溫度為-20℃環(huán)境中所保存的血漿，在保存的3 d時(shí)間內(nèi)，他唑巴坦鈉濃度在下降幅度方面均小于10%，而在5 d之內(nèi)，其存在有大于10%的變化趨勢。至此可知，在實(shí)施分次采集血樣操作過程中，需在3 d之內(nèi)將其完成測定工作，當(dāng)完成他唑巴坦鈉血漿樣品通過蛋白沉淀處理操作之后，所得到的溶液放置室溫中，其在3 h內(nèi)在變化方面不會大于10%，而若超過7 h，則其下降會>15%，所以，需在3 h內(nèi)完成樣品的測定處理工作。
2.7 患者標(biāo)準(zhǔn)
接受CRRT的患者，同時(shí)符合：（1）年齡：18～70歲;（2）無青霉素過敏史且青霉素皮試陰性;（3）既往無慢性肝、腎功能不全病史;（4）行CRRT前1周內(nèi)未使用過含哌拉西林及他唑巴坦成分的藥物;（5）臨床判斷單用或聯(lián)用哌拉西林/他唑巴坦可以有效覆蓋可能致病菌;（6）本人或授權(quán)人書面同意接受本研究。
2.8 哌拉西林鈉他唑巴坦鈉人體藥動學(xué)
（1）哌拉西林鈉。單次試驗(yàn)1：選取12例符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者，對試劑實(shí)施靜脈滴注，即哌拉西林/他唑巴坦（1 g/0.25 g）/次，采用生理鹽水100 mL溶解，對滴速予以嚴(yán)格控制，恒速運(yùn)行，滴注時(shí)間為30 min。各受試者于實(shí)施靜脈滴注前，以及開始滴注之后5、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min分別抽取5 mL外周靜脈血。血樣經(jīng)10 min、3000 r/min離心后取上清液2 mL，-80℃保存，等待檢測。單次試驗(yàn)2：所選取12例嚴(yán)重膿毒癥受試者在單次實(shí)驗(yàn)1以后48 h后，再次對試劑實(shí)施靜脈滴注，即哌拉西林/他唑巴坦（2 g/0.5 g）/次，方法同上。
2.9 方法的專屬性
（1）哌拉西林鈉。選取6例嚴(yán)重膿毒癥受試者，取其0.25 mL空白血漿;依據(jù)2.2項(xiàng)相關(guān)操作，實(shí)施15 μL進(jìn)樣，對色譜圖予以記錄;在空白血漿中，將哌拉西林鈉溶液放置其中依據(jù)相同方法，便可得出色譜圖，保存時(shí)間控制在5 min;當(dāng)患者完成給藥滴注之后，取其血漿樣品，依據(jù)上述操作，得出色譜圖;然后對比各色譜圖，見圖1（A、B、C）所示。（2）他唑巴坦鈉。另取6例嚴(yán)重膿毒癥受試者，取其0.25 mL空白血漿;依據(jù)2.2項(xiàng)相關(guān)操作，實(shí)施15 μL進(jìn)樣，對色譜圖予以記錄;在空白血漿中，將他唑巴坦鈉溶液放置其中依據(jù)相同方法，便可得出色譜圖，保留時(shí)間8 min;當(dāng)患者完成給藥滴注之后，取其血漿樣品，依據(jù)上述操作，得出色譜圖;然后對比各色譜圖，圖1（D、E、F）所示。
2.10制劑給藥藥動學(xué)
所選取的12例嚴(yán)重膿毒癥受試者，當(dāng)其完成哌拉西林鈉他唑巴鈉30 min靜脈滴注后，其藥動學(xué)參數(shù)，見表1。
表1? ?哌拉西林鈉他唑巴鈉靜滴的藥動學(xué)參數(shù)
結(jié)果可知，哌拉西林鈉（1.0 g）完成30 min靜滴之后，其與哌拉西林鈉（2.0 g）完成靜滴之后的計(jì)量比為50.0%，二者之間的AUC0～6比為47%，Cmax為49%，在計(jì)量方面呈現(xiàn)相關(guān)性。而在完成靜脈滴注劑量為他唑巴坦鈉（0.50 g）與他唑巴坦鈉（0.25 g）的比值則為50%，二者之間的AUC0～6比為44%，Cmax為47%，在計(jì)量方面呈現(xiàn)相關(guān)性。
3討論
本次試驗(yàn)研究構(gòu)建的基于血漿的HPLC-MS/MS測定法，患者血漿當(dāng)中的雜質(zhì)，對樣品峰不造成干擾，基于此種試驗(yàn)環(huán)境下，其具有較好的重復(fù)性，特異性也較好，具有較高的靈敏度、精密度及回收率，在質(zhì)量控制方面也與相關(guān)要求相符，與生物樣品具體的分析要求也相符[8-12]。
國外研究表明，CRRT時(shí)幾乎所有抗菌藥物的藥代動力學(xué)都會發(fā)生改變，影響程度可能取決于藥物的分子量、分布容積、蛋白結(jié)合率、濾器的材質(zhì)、CRRT模式等等多種因素[13-20]。國內(nèi)范珠[11]對健康志愿者的研究顯示靜滴哌拉西林/他唑巴坦（2 g/0.5 g）后Cmax分別為（152.7±23.8）mg/L和（32.8±5.8）mg/L，t1/2分別為（1.3±0.5）h和（0.95±0.18）h，與本研究實(shí)測結(jié)果有較大差異，初步證實(shí)了CRRT確實(shí)會對哌拉西林他唑巴坦的藥代學(xué)造成較大影響。本研究構(gòu)建的HPLC-MS/MS方法可以準(zhǔn)確、靈敏地檢測CRRT時(shí)哌拉西林他唑巴坦的血藥濃度，為臨床對接受CRRT的膿毒癥患者制定更加合理的給藥方案提供了一項(xiàng)切實(shí)可行的手段，有助于發(fā)揮哌拉西林/他唑巴坦的最大療效、改善患者的預(yù)后。
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（收稿日期：2018-06-27）
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