香豆素基甲醛熒光探針的合成及其性能研究

李和平， 陳忠曉， 秦鑫鑫， 江 升， 趙 超, 肖 青

(1.道路結(jié)構(gòu)與材料交通行業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,湖南長沙 410114; 2.云南水利水電職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)教育部,云南昆明 650499)

甲醛(FA)是一種重要的工業(yè)原料,它廣泛應(yīng)用于制造業(yè)、食品防腐和藥物合成等領(lǐng)域,因其與DNA和蛋白質(zhì)具有非常強(qiáng)大的結(jié)合力,長期暴露于甲醛環(huán)境中會導(dǎo)致記憶力衰退和各種神經(jīng)性疾病[1]。但現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),在組蛋白去甲基化或DNA甲基化過程中，以及甲胺和多胺的降解過程中，生物系統(tǒng)中可能產(chǎn)生內(nèi)源性甲醛[2]，但它在體內(nèi)發(fā)揮何種生理功能尚不可知，因此，開發(fā)可檢測甲醛的有效成像劑有利于研究內(nèi)源性甲醛的生理功能。目前檢測甲醛的主要方法有比色法、電化學(xué)法、熒光分光光度法、高效液相色譜法和紅外光譜法[3]。相比其他幾種方法,熒光分光光度法具有靈敏度高、操作方便、重現(xiàn)性好、實(shí)時(shí)檢測等特點(diǎn),但是由于現(xiàn)在所用到的成像劑大多含有萘環(huán)[4 - 5]、二酮類[6]對人體有毒化合物,因此開發(fā)生物系統(tǒng)背景下檢測甲醛的優(yōu)秀分子工具,在臨床診斷方面具有重要意義。

香豆素廣泛存在于蕓香科、豆科、茄科等天然植物和微生物代謝產(chǎn)物中,在熒光分析、染料、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著極其廣泛的應(yīng)用[7]，而且作為一種天然產(chǎn)物，不僅對人體無毒，且具有抗病毒、抗癌等生理功能,特別是在抗HIV活性、抑制癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋亡方面表現(xiàn)出優(yōu)秀的藥理特性[8]，以香豆素類衍生物為熒光團(tuán)的熒光探針具有熒光量子產(chǎn)率高,Stokes位移大,光穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[9 - 10]。因此，最近幾年香豆素類衍生物應(yīng)用于有機(jī)熒光染料的研究得到了廣泛的重視。

本文基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)機(jī)理,將肼與4-甲基-7-羥基-8-甲?；愣顾叵嘟Y(jié)合,引入甲腙基作為熒光猝滅基團(tuán)和甲醛識別基團(tuán),得到了一種檢測甲醛的新型熒光探針4-甲基-7-羥基-8-甲酰基香豆素(CNH)，為研究內(nèi)源性甲醛的生理功能提供有效的分子工具。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Aglient 1100 series 液相色譜/質(zhì)譜儀(美國，安捷倫公司);Varian Mecury(300 MHz)核磁共振儀(美國，VARIAN公司);JY02S型紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司);MCR-3型微波化學(xué)反應(yīng)器(上海標(biāo)和儀器有限公司);Avatar-360紅外光譜儀(美國，Nicolet);U-4100紫外光譜儀(日本，日立公司);SGWX-4顯微熔點(diǎn)測定儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司);F-7000熒光光譜儀(日本，日立公司)。

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純，無需進(jìn)一步處理。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.14-甲基-7-羥基香豆素(MC)的合成參考文獻(xiàn)方法[11]合成并有所改進(jìn),主要改進(jìn)的是采用H3PO4(85%)作為催化劑。

1.2.24-甲基-7-羥基-8-甲酰基香豆素(MFC)的合成取4-甲基-7-羥基香豆素10.2470 g(0.058 mol),六亞甲基四氨(HMTA)19.8292 g(0.142 mol),置于500 mL的圓底燒瓶中.加入100 mL的冰HAc,溫度90 ℃下水浴回流5 h后,微波10 min(90 ℃);自然冷卻至室溫后加入150 mL 20%HCl,70 ℃下繼續(xù)水浴回流1 h,再微波10 min(70 ℃);自然冷卻后倒入500 mL冰水混合物中充分?jǐn)嚢? h,析出大量的黃色固體;用200 mL×1,100 mL×2的乙酸乙酯萃取，合并萃取液后,無水Na2SO4干燥;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至剩余少量液體后,過濾(相當(dāng)于進(jìn)行一次重結(jié)晶),真空干燥得淡黃色產(chǎn)物1.5163 g,產(chǎn)率12.80%。

m.p.:179～181 ℃;IR(KBr):3 428.86 cm-1(-OH),1 723.63 cm-1(-CO),1 607.69 cm-1(-CHO),1 594 cm-1(-C=C);1H NMR(300 MHz,DMSO-d6):δ:2.43(s,3H,C4-CH3),6.32(s,1H,C3-H),6.93(d,1H,C6-H,J=8.9 Hz),7.93～7.97(d,1H,C5-H,J=8.9 Hz),10.46(s,1H,CHO),11.90(s,1H,OH);MS:m/z204.1(M+),分子式C11H8O4,計(jì)算值204.0。

1.2.3探針CNH的合成在50 mL的圓底燒瓶中,加入MFC 0.8932 g(4.38 mmol),20 mL的乙醇,5 mL 的水合肼,于70 ℃下水浴回流4.5 h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至剩余少量溶液,過濾,水洗2次,乙醇洗一次,真空干燥得泛黃白色固體0.8020 g,產(chǎn)率為83.97%。

1H NMR(300 MHz,DMSO-d6):δ:2.40(s,3H,C4-CH3),6.21(s,1H,C3-H),6.86～6.88(d,1H,C6-H,J=8.9 Hz),7.36(s,2H,-NH2),7.56(d,1H,C5-H,J=8.9 Hz),8.42(s,1H,-CH=N-),12.79(s,1H,OH);MS：m/z218.1(M+),分子式C11H10N2O3,計(jì)算值218.1。

1.2.4CNH-甲醛的合成在50 mL的圓底燒瓶中,加入探針CNH 0.3027 g(1.316 mmol),2 mL甲醛(≥37%),18 mL去離子水，室溫下攪拌10 min,過濾,水洗,真空干燥,得泛黃白色固體0.2510 g,產(chǎn)率為76.80%。

MS：m/z230.1(M+),分子式C12H10N2O3,計(jì)算值230.1。

1.3 溶液的配制

室溫下,將探針CNH和化合物CNH-甲醛，分別溶解于二甲基亞砜(DMSO)中,加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，配制成1 mmol/L的儲備液(pH=7.4)。實(shí)驗(yàn)所用到的甲醛、氨基酸等其它分析物均先溶于DMSO,再加入PBS，配制成1 mmol/L的儲備溶液(pH=7.4)。實(shí)驗(yàn)時(shí)所需不同濃度的溶液均以PBS(pH=7.4)稀釋得到。

1.4 熒光光譜測定

1.4.1探針對甲醛的響應(yīng)性在10 mL 30 μmol/L CNH的PBS(pH=7.4)中,加入0～200 μmol/L的甲醛溶液,在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,振蕩后靜置1 min,測定熒光光譜。

1.4.2探針對甲醛的響應(yīng)時(shí)間在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,測定30 μmol/L CNH的PBS(pH=7.4)的熒光光譜,然后立即加入等物質(zhì)的量的甲醛溶液,持續(xù)掃描10 min,測量時(shí)間響應(yīng)曲線。

1.4.3探針的選擇性取不同的分析物各1 mmol/L,加入30 μmol/L CNH的PBS(pH=7.4),靜置1 0 min后,在相同的實(shí)驗(yàn)條件下測量熒光光譜,隨后在三色紫外燈下進(jìn)行比色測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針CNH的設(shè)計(jì)與合成

基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)[4]機(jī)理,設(shè)計(jì)合成了新型熒光探針CNH。探針CNH的合成路線如圖1所示。

圖1 CNH合成路線及其檢測甲醛的機(jī)理Fig.1 Synthesis of probe CNH and the mechanism of the “off-on” detection for formaldehyde(FA)

很多文獻(xiàn)對4-甲基-7-羥基香豆素的合成早已有報(bào)道,常用的方法有Perkin反應(yīng)和Pechmann反應(yīng)[11]。本文采用簡單易行的Pechmann合成法構(gòu)建4-甲基-7-羥基香豆素?zé)晒鈭F(tuán),實(shí)驗(yàn)以H3PO4(85%)為反應(yīng)催化劑,避免了強(qiáng)酸的加入,利用廉價(jià)易得的間苯二酚與乙酰乙酸乙酯，在室溫條件下反應(yīng)得到MC,繼而采用Duff反應(yīng)[12]將其8號位甲酰基化,整個實(shí)驗(yàn)原料易得，條件溫和,副反應(yīng)少,均采取重結(jié)晶的方式提純目標(biāo)產(chǎn)物,省去了硅膠色譜柱純化,操作簡單。探針CNH對甲醛的識別機(jī)理是在由于探針CNH的-NH2的給電子作用，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移受阻,熒光猝滅，與甲醛作用后生成-N=CH2而熒光恢復(fù)[4]。

2.2 甲醛濃度對探針CNH熒光強(qiáng)度的影響

圖2 甲醛濃度(0～400 μmol/L)對CNH(5 μmol/L)熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of FA concentrations on the probe CNH(5 μmol/L) fluorescence intensities in PBS buffer 25 ℃，pH=7.4,1%DMSO，λex=325 nm.

基于本研究是以檢測內(nèi)源性甲醛為目標(biāo)，因此選定血液(pH=7.4)和室溫作為研究的固定條件，下述研究都在此基礎(chǔ)上進(jìn)行。為了測定探針CNH對甲醛的敏感性,向探針CNH溶液中加入不同濃度甲醛，立即測定其熒光光譜,如圖2所示。由圖2可知，隨著甲醛濃度的升高(0～400 μmol/L),探針CNH溶液的熒光強(qiáng)度不斷增大,當(dāng)甲醛濃度達(dá)到100 μmol/L,探針溶液的熒光強(qiáng)度幾乎不變。取甲醛濃度0～100 μmol/L，λem=450 nm的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，并線性擬合,得到(Imin-I)/(Imin-Imax)對甲醛濃度的對數(shù)lgc的線性回歸曲線方程為:y=0.9523x+4.7652，相關(guān)系數(shù)R2=0.9876,由此計(jì)算得探針CNH對甲醛的檢測限為1.0×10-5mol/L。

2.3 探針CNH對甲醛的響應(yīng)時(shí)間研究

為了測定探針CNH對FA的響應(yīng)時(shí)間，將等物質(zhì)的量的探針CNH與甲醛溶液混合，測定不同時(shí)間后的熒光強(qiáng)度,如圖3所示。由圖3可知，探針CNH與甲醛的反應(yīng)在室溫下約400 s即可完成，說明探針CNH對甲醛具有反應(yīng)快速的優(yōu)點(diǎn)。

2.4 探針CNH對甲醛的選擇性研究

探針的專一性選擇是評價(jià)其性能的重要因素。為了研究探針對甲醛的選擇特異性,采用熒光光譜測定探針CNH對其它分析物的響應(yīng)性，如圖4所示。由圖4可知，探針CNH與甲醛溶液混合后,顯示出了更強(qiáng)的熒光信號,表明探針對甲醛具有高度的特異性。用三色紫外燈(波長365 nm)照射探針CNH與甲醛等不同分析物混合后的溶液，發(fā)現(xiàn)探針CNH與甲醛的混合溶液發(fā)微弱的光,而探針CNH與CuSO4、丙酮等其它物質(zhì)混合后的溶液發(fā)出亮光，探針CNH對甲醛在紫外燈下具有獨(dú)特的顏色顯示，通過裸眼即可快速比色檢測，為實(shí)現(xiàn)對環(huán)境中甲醛的實(shí)時(shí)監(jiān)測提供便利。

圖3 CNH(5 μmol/L)熒光強(qiáng)度在有(A)和無(B)甲醛(5 μmol/L)時(shí)隨時(shí)間變化曲線Fig.3 Reaction-time profiles of the probe CNH(5 μmol/L) in the presence(A) and absence(B) of FA(5 μmol/L) in PBS buffer 25 ℃，pH=7.4,1%DMSO，λex/λem=325/450 nm.

圖4 探針CNH(10 μmol/L)在各種分析物存在時(shí)的熒光強(qiáng)度Fig.4 Fluorescence intensity of probe CNH(10 μmol/L) in the presence of various analyte in 20 mmol/L PBS buffer(pH=7.4) 1%DMSO,λex/λem=325/450 nm.1:free CNH;2:H2O2;3:CuSO4;4:CaCl2;5:FA;6:CH3CHO;7:C6H5CHO;8:glycine;9:acetone.

3 結(jié)論

以香豆素衍生物為熒光團(tuán),構(gòu)建合成了一種新型的檢測甲醛的熒光探針(CNH)。該熒光探針CNH對甲醛具有高的選擇性和靈敏度、低檢測限和響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn),而且與現(xiàn)有的檢測甲醛的探針相比，探針CNH以天然香豆素結(jié)構(gòu)為母核，本身無毒性，可作為研究內(nèi)源性甲醛的生理功能的熒光探針。而且，在紫外光照射下,通過比色可實(shí)現(xiàn)裸眼識別，為環(huán)境部門快速有效監(jiān)測甲醛提供了有效的分子工具,在甲醛檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。