鹽澤瀉飲片指紋圖譜及萜類成分含量測定研究

樊李明， 邰艷妮， 林小栩， 張?zhí)K萍， 林青青， 林珠燦*， 褚克丹*， 謝瑞華

(1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州 350122； 2.福建承天藥業(yè)有限公司，福建南平 350002)

澤瀉是我國栽培歷史悠久的傳統(tǒng)常用中藥材，是水生或沼生草本澤瀉科植物澤瀉(Alismaorientale(Sam.)Juzep.)的干燥塊莖[1]，主要產于福建、四川、江西等地。中醫(yī)理論認為澤瀉具有利水滲濕、泄熱通淋的功效，現代藥理研究表明澤瀉具有降脂、降糖、降血壓、利尿、抗腫瘤、抗炎、抗脂肪肝等作用。澤瀉在中醫(yī)臨床上有較長的應用歷史，《中國藥典》(2015年版)收載的澤瀉炮制品為鹽澤瀉飲片。鹽澤瀉于清代[2]開始使用，其引藥下行，增強滋陰瀉熱及利尿作用，也是澤瀉臨床上最常應用的炮制品種?，F代藥理研究表明鹽澤瀉具有利尿、抗脂肪肝等作用，而對于鹽澤瀉的質量控制研究報道較少。

關于鹽澤瀉指紋圖譜的研究，陳瑩等[3]開展了鹽澤瀉的生產加工及指紋圖譜的研究，在208、245 nm波長下分別標定了17、10個共有峰，并對其中4個三萜類成分含量進行測定；張敏娜等[4]建立了鹽澤瀉的氣相色譜指紋圖譜，進行了程序升溫條件以及方法學考察，從中標定出18個共有峰；劉小曼等[5]進行了提高鹽澤瀉飲片質量標準的研究，采用高效液相色譜-電噴霧電離質譜技術指認了6個特征峰；劉文琴等[6]通過建立高效液相色譜指紋圖譜，探討了不同澤瀉炮制品成分的差異，標定了14個特征峰。超高效液相色譜法(UPLC)分析速度快，靈敏度高，可以節(jié)約分析時間，但是采用UPLC建立鹽澤瀉指紋圖譜的方法還未見報道。目前對于鹽澤瀉的含量測定研究，指標成分的選擇多以三萜類成分[7 - 10]作為指標進行評估，檢測指標較為單一。有研究表明，澤瀉有效成分除三萜類外，其倍半萜類成分也具有澤瀉傳統(tǒng)的顯著的抗炎和降壓作用。倍半萜類成分環(huán)氧澤瀉烯具有抗炎作用，澤瀉烯醇具有降壓作用，也是澤瀉重要的藥效物質基礎，應作為其鹽澤瀉飲片質量研究的指標成分。因此本實驗采用UPLC法對不同來源的鹽澤瀉飲片建立指紋圖譜，并同時測定其中6種萜類成分的含量，為提高鹽澤瀉飲片的整體質量控制方法提供科學的實驗依據。

1 實驗部分

1.1主要儀器、試劑與材料

1290系列超高效液相色譜儀(美國，Angilent公司)；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國，Sartorius公司)；KQ-500E臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FY135型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

對照品：23-乙酰澤瀉醇B(批號：111846-201504，購自中國食品藥品檢定研究院，純度99.90%)；澤瀉醇B(批號：MUST-17032208，購自成都曼斯特生物有限公司，純度≥98.5%)；環(huán)氧澤瀉烯(批號：MUST-13010606，購自成都曼斯特生物有限公司，純度≥98%)；澤瀉醇A(批號：MUST-17032402，購自成都曼斯特生物有限公司，純度≥99.36%)；23-乙酰澤瀉醇C(批號：MUST-17040506，購自成都曼斯特生物有限公司，純度≥99.84%)；澤瀉烯醇(批號：87827-55-2，購自西力生物技術股份有限公司，純度96%)。乙腈為色譜純(德國Merck公司)，水為娃哈哈純凈水。

49批鹽澤瀉樣品產地分別來自福建、江西和四川，經福建中醫(yī)藥大學生藥教研室林青青鑒定，為澤瀉科植物澤瀉(Alismaorientale(Sam.)Juzep.)的干燥塊莖，樣本存放于福建中醫(yī)藥大學藥學院藥用植物標本室。樣品信息如下：S1(160904381)、S2(160800471)、S3(160908031)來自康美藥業(yè)股份有限公司(福建)，S4(171004)、S5(171005)、S6(171002)、S7(171003)、S8(171001)、S9(171204)、S10(171201)來自福建承天藥業(yè)有限公司(福建)，S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S18來自福建GAP吉陽基地澤瀉自制飲片8(福建)，S19、S20、S21、S22、S23、S24來自江西驛前鎮(zhèn)澤瀉基地自制飲片6(江西)，S25(601113984)、S26(601113984)來自北京同仁堂(亳州)飲片有限責任公司(福建)，S27(160901)來自湖北強康中藥飲片有限公司(福建)，S28(B706061-01)來自河北楚風中藥飲片有限公司(福建)，S29(160411)來自亳州中正中藥材有限公司(福建)，S30(170314)來自廈門燕來福制藥有限公司(福建)，S31(20160421)來自福建省尤溪仙錦藥業(yè)有限公司(福建)，S32、S33、S34來自彭山藥材自制飲片3，S35、S36、S37、S38來自樂山藥材自制飲片2(四川)，S39(20150601)來自安徽井泉集團中藥飲品有限公司(四川)，S40(170101)、S41(170701)來自安國祁安藥業(yè)有限公司(四川)，S42(171009)來自廈門燕來福制藥有限公司(四川)，S43(170701)來自四川省天府神龍中藥飲片有限公司(四川)，S44(170728)來自云南福林堂藥業(yè)有限公司中藥飲片廠(四川)，S45(20171101)來自樟樹市仁德中藥飲片有限公司(四川)，S46(P2017021109)、S47(P201605118)來自江西宏潔中藥飲片有限公司(江西)，S48(1612011)來自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司(江西)，S49(20170101)來自江西青春康康源中藥飲片有限公司(江西)。

1.2 實驗方法

1.2.1混合對照品溶液的制備取環(huán)氧澤瀉烯，23-乙酰澤瀉醇C，澤瀉醇A，澤瀉烯醇，澤瀉醇B及23-乙酰澤瀉醇B對照品適量，精密稱定，加入乙腈制備成濃度分別為1.020、1.021、1.010、1.000、0.904、1.050 mg·mL-1的單一對照品儲備液。分別精密量取上述對照品溶液適量，置同一容量瓶中，加入50%乙腈溶液至刻度，制成6個化合物濃度分別為51.00、51.05、50.50、50.00、45.20、52.50 μg·mL-1的混合對照品溶液。

1.2.2供試品溶液制備取樣品粉末(過5號篩)約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙腈25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min使溶解，冷卻，再稱定重量，用乙腈補足減失的重量，提取液10 000 r·min-1離心10 min，0.22 μm濾膜濾過，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫：0～0.2 min，35%～35%A；0.2～2.5 min，35%～55%A；2.5～3.5 min，55%～55%A；3.5～6.5 min，55%～73%A；6.5～9.5 min，73%～87%A；9.5～11 min，87%～87%A。流速0.35 mL·min-1，柱溫35 ℃，進樣體積2 μL，檢測波長208 nm。

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇

實驗對提取方法中的樣品取樣量、提取溶劑(不同濃度的乙腈)、超聲條件(功率、頻率)、溶劑倍量、提取時間、提取次數等進行了考察，最終確定了供試品溶液的制備方法，即取1.0 g樣品粉末，提取溶劑為25 mL純乙腈，超聲(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，提取1次，此時樣品中各成分基本提取完全。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實驗采用乙腈-水作為流動相，梯度洗脫，其基線平穩(wěn)，分離效果較好，符合指紋圖譜和含量測定研究的要求，因此作為測定鹽澤瀉飲片的流動相體系。同時也對不同品牌的C18柱進行考察，結果顯示采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱時，洗脫出的色譜峰峰形較好，所得色譜圖峰數較多，保留時間適中，對6種萜類成分分離效果較好。同時也對樣品提取物進行紫外全波長掃描，綜合最大吸收情況，檢測波長為208 nm時的色譜峰數目較多且靈敏度高，峰面積較好，所以確定208 nm為檢測波長。此外，還考察了柱溫對分離的影響，最終確定柱溫為35 ℃。

2.3 鹽澤瀉飲片指紋圖譜的建立

2.3.1精密度試驗精密吸取同一份鹽澤瀉供試品2 μL，連續(xù)進樣6次記錄色譜圖，以23-乙酰澤瀉醇B為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間相對標準偏差(RSD)均<0.42%，相對峰面積RSD均<3.48%，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)”進行評價，相似度為0.99，表明儀器精密度較好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗精密吸取同一份供試品溶液2 μL，分別在0、2、4、8、12和24 h進樣，記錄色譜圖，以23-乙酰澤瀉醇B為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD均<0.44%，相對峰面積RSD均<2.93%，相似度為0.99，表明供試品溶液24 h內穩(wěn)定。

2.3.3重復性試驗取同一批鹽澤瀉粉末6份，制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液2 μL并進樣，記錄色譜圖，以23-乙酰澤瀉醇B為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD均<0.36%，相對峰面積RSD均<3.64%，相似度為0.99，表明該方法重復性較好。

圖1 49批鹽澤瀉飲片指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of 49 bateches of salted alismatis rhizoma1.Alismoxide；5.23-acetyl alisol C；7.Alisol A；9.Alismol；11.Alisol B；12.Alisol B 23-acetate.

2.3.4鹽澤瀉飲片指紋圖譜的生成將49批鹽澤瀉飲片的供試品溶液進樣2 μL并測定，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)”進行數據處理，建立鹽澤瀉飲片的對照指紋圖譜，設定S1為參照圖譜，采取中位數法，選取“時間窗”寬度為0.4 min，經數據匹配和多點校正生成鹽澤瀉飲片的共有模式，建立鹽澤瀉飲片的指紋圖譜，見圖1。

2.3.5共有峰的標定根據建立的指紋圖譜結果，在對照指紋圖譜上共標定出共有色譜峰14個，見圖1。色譜圖中保留時間(tR)為8.625 min處的12號色譜峰(23-乙酰澤瀉醇B)響應較高，分離良好，保留時間合適，故選此峰為參照峰。與混合對照品比對指認了其中6種萜類成分的共有峰，分別為環(huán)氧澤瀉烯，23-乙酰澤瀉醇C，澤瀉醇A，澤瀉烯醇，澤瀉醇B及23-乙酰澤瀉醇B，見圖2。

圖2 鹽澤瀉飲片6個混合對照品(A)和供試品色譜圖(B)Fig.2 Chromatograms of reference(A) and salted alismatis rhizoma sample(B)A.Mixed standard；B.salted Alismatis Rhizomasample；1.Alismoxide；2.23-acetyl alisol C；3.Alisol A；4.Alismol；5.Alisol B；6.Alisol B 23-acetate.

2.3.6鹽澤瀉飲片指紋圖譜相似度的測定采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)”，對49批不同產地鹽澤瀉飲片的指紋圖譜檢測數據進行數據處理，分析了49批鹽澤瀉飲片的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，見表1。49批鹽澤瀉樣品中有22批樣品的相似度>0.9，結果說明不同產地鹽澤瀉飲片的化學成分種類差別不大，各樣品共有峰的相對保留時間基本相同，而共有峰的相對峰面積存在著不同程度的差異，猜測可能是由于澤瀉原藥材不同的產地，生長，采收，加工以及鹽飲片炮制方法等因素導致其有效成分含量具有差異，其原因有待進一步的探究。

表1 49批鹽澤瀉飲片與對照指紋圖譜的相似度

圖3 鹽澤瀉樣品聚類分析樹狀關系Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of salted alismatis rhizoma

圖4 鹽澤瀉樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis of salted alismatis rhizoma

2.3.7聚類分析將49批不同產地鹽澤瀉飲片各色譜峰面積作為原始數據，運用DPS 16.0軟件進行系統(tǒng)聚類分析，見圖3?？傻?9批樣品在閾值大于18.0時，鹽澤瀉飲片樣品可以分為2大類，S38、S37、S36、S35、S34、S33、S32、S45、S48、S44、S43、S30、S42、S46、S28、S47、S41、S31、S39、S27、S40、S29、S49、S26、S25為川澤瀉，其余樣品為建澤瀉。但是產地為福建的7批樣品和江西的4批樣品，即S25、S26、S27、S28、S29、S30、S31和S46、S47、S48、S49卻劃分在川澤瀉的一類，這與福建和江西自制飲片的歸類情況存有差異，猜測可能由于廠家澤瀉種源溯源或者品種存有差異，使得其在含量上的規(guī)律與川澤瀉一致。從含量測定結果看，澤瀉醇B含量范圍為0.138～0.532 mg·g-1聚為建澤瀉一類，含量高的0.794～5.914 mg·g-1聚為川澤瀉一類。此外，閾值在8.0～18.0時川澤瀉又可分為2類，即S38、S37、S36、S35、S34、S33、S32為一類；S45、S48、S44、S43、S30、S42、S46、S28、S47、S41、S31、S39、S27、S40、S29、S49、S26、S25為一類。從含量測定的結果來看，是將澤瀉烯醇和23-乙酰澤瀉醇B的含量相對較高的川澤瀉聚為一類，即澤瀉烯醇含量范圍為1.274～1.913 mg·g-1，23-乙酰澤瀉醇B的含量范圍為2.391～2.992 mg·g-1；而澤瀉烯醇和23-乙酰澤瀉醇B的含量相對較低的川澤瀉聚為另一類，即澤瀉烯醇含量范圍為0.432～1.024 mg·g-1，23-乙酰澤瀉醇B的含量范圍為1.054～1.808 mg·g-1。從聚類結果和含量測定結果上分析，澤瀉醇B、澤瀉烯醇、23-乙酰澤瀉醇B是影響聚類結果的主要成分。為了進一步說明這6個成分的貢獻率大小，對這6個成分的含量進行主成分分析(PCA)分析，見圖4。由軟件讀出環(huán)氧澤瀉烯、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇A、澤瀉烯醇、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B的因子大小分別為0.3873、0.1782、0.0681、0.5505、0.5467、0.4601，因子越大對主成分的分子貢獻越大，澤瀉烯醇、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B在主成分分析中為主要的貢獻成分；結合聚類、主成分分析、含量測定結果進行分析，建議這三個成分作為澤瀉的質量評估指標。

2.4鹽澤瀉飲片中6種萜類成分含量測定

2.4.1線性關系的考察精密移取混合對照品溶液適量，用50%乙腈分別稀釋至質量濃度分別為4、6、8、10、20、40、80、100、200、400倍的10種系列混合對照品溶液，搖勻，按上述色譜條件分別精密吸取2 μL進樣并測定峰面積，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸分析，得到回歸方程和相關系數。環(huán)氧澤瀉烯，23-乙酰澤瀉醇C，澤瀉醇A，澤瀉烯醇，澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B的回歸方程分別為：Y=4.847X-0.1488(r=0.9995)，Y=7.184X-0.1535(r=0.9994)，Y=5.033X+0.1624(r=0.9998)，Y=2.812X-0.2135(r=0.9992)，Y=5.027X-0.1916(r=0.9995)，Y=4.958X-0.1864(r=0.9999)。結果表明環(huán)氧澤瀉烯，23-乙酰澤瀉醇C，澤瀉醇A，澤瀉烯醇，澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B質量濃度分別在2.040～204.0 μg·mL-1，2.042～204.2 μg·mL-1，2.020～202.0 μg·mL-1，2.000～200.0 μg·mL-1，1.808～180.8 μg·mL-1，2.100～210.0 μg·mL-1范圍時線性良好。

2.4.2精密度試驗精密吸取同一份混合對照品溶液2 μL，按1.2.3項下色譜條件，重復進樣6次，測定環(huán)氧澤瀉烯，23-乙酰澤瀉醇C，澤瀉醇A，澤瀉烯醇，澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B 6種對照品峰面積的RSD分別為1.88%、1.24%、1.77%、1.15%、1.35%和1.68%，說明儀器精密度較好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，按1.2.3項下色譜條件，分別于0、2、6、12、18、24 h進樣并測定6種萜類成分，結果其峰面積的RSD分別為2.29%、1.46%、2.35%、2.03%、1.11%和1.41%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性較好。

2.4.4重復性試驗精密稱取同一批鹽澤瀉樣品粉末6份，按1.2.2項下制備供試品溶液，各精密吸取2 μL，進樣并測定6種萜類成分的峰面積，計算6種萜類成分的含量，結果其含量RSD分別為2.90%、1.58%、2.11%、2.58%、2.69%和2.92%，表明該方法重復性較好。

2.4.5加樣回收率試驗精密稱取6份已知含量的同一批鹽澤瀉飲片粉末1.0 g，分別精密加入一定量的6種混合對照品溶液，按1.2.2項下制備供試品溶液，再按1.2.3項下色譜條件測定峰面積，計算出6種萜類成分的含量，得到平均回收率分別為97.8%、98.4%、99.3%、97.8%、98.8%和99.4%，RSD分別為2.45%、2.18%、2.36%、2.14%、2.75%和2.59%。

2.4.6樣品含量測定結果分別精密稱取49批不同來源的鹽澤瀉樣品1.0 g，按1.2.2項下制備供試品溶液，按1.2.3項下的方法測定環(huán)氧澤瀉烯，23-乙酰澤瀉醇C，澤瀉醇A，澤瀉烯醇，澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B的含量，結果見表2。江西產澤瀉從生源地理上認為是建澤瀉，因此兩者化學成分比較接近。但從含量測定的結果可以看出，收集的江西產鹽澤瀉與川澤瀉在含量上有著相似之處，這與廣昌自制飲片差異較大，推測廠家在原料的溯源上可能存在偏差。

表2 鹽澤瀉飲片6種萜類成分的含量測定(mg·g-1)

(續(xù)表2)

3 結論

本實驗采用UPLC法對49批鹽澤瀉飲片進行分析，建立了鹽澤瀉飲片指紋圖譜，并標定了14個共有峰，同時測定出其中環(huán)氧澤瀉烯，23-乙酰澤瀉醇C，澤瀉醇A，澤瀉烯醇，澤瀉醇B及23-乙酰澤瀉醇B 6種萜類成分的含量，并結合聚類分析、主成分分析、含量測定結果，建議澤瀉醇B、澤瀉烯醇、23-乙酰澤瀉醇B這三個成分作為澤瀉質量評估的指標。本方法結果準確，重現性好，穩(wěn)定性高，靈敏度高，分析時間短，適用于鹽澤瀉飲片指紋圖譜及6種萜類成分的含量測定，為鹽澤瀉飲片的質量控制提供了一定的依據。