miR-146a對(duì)血小板免疫炎癥功能的影響*

徐吉淋，王路喬，梁 倩，楊人強(qiáng)

(1.長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 430019;2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,南昌 330006；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，昆明650031;4.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院分子中心,南昌 330006)

血小板的激活和各種血小板因子的釋放是觸發(fā)急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)的始動(dòng)和核心環(huán)節(jié)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，血小板的激活不僅能促進(jìn)血栓形成，還能激活機(jī)體免疫炎性反應(yīng)[1-2]。血小板表面存在Toll樣受體4(TLR4)、CD40L、P-selectin等免疫分子。TLR4的表達(dá)在活化和非活化的血小板之間不同,活化的血小板TLR4表達(dá)明顯升高[3-4]。TLR4在ACS患者單核細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并且這些過(guò)表達(dá)的TLR4通過(guò)TLR4/核因子(NF)-κB信號(hào)通路調(diào)控免疫炎性反應(yīng)[5-6]。近年有研究表明，血小板、巨核細(xì)胞中存在大量有功能的NF-κB家族成員，并且它們和血小板免疫炎癥密切相關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究[7]。miR-146是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)作用的miRNA,其能誘導(dǎo)巨核細(xì)胞增生分化[8]，并且在小鼠成熟巨核細(xì)胞中表達(dá)增加[9]。在血小板生成過(guò)程中，巨核細(xì)胞中線粒體、核糖體等細(xì)胞器及多種不同細(xì)胞因子的pre-mRNA轉(zhuǎn)移到血小板，因此miRNA通過(guò)影響巨核細(xì)胞中mRNA的合成進(jìn)一步影響血小板功能[9]。本文研究miR-146a對(duì)巨核細(xì)胞裂解產(chǎn)生的血小板免疫炎癥功能的影響，為抑制血小板免疫炎癥的治療提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院分子中心饋贈(zèng)；高糖1640培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS，以色列BI公司)； miR-146a mimic、miR-146a inhibitor、mimic-NC、inhibibor-NC、miR-146a/U6的RT-qPCR引物(吉瑪公司)； lipofectmine 2000(全式金公司)； TLR4一抗(美國(guó)Proteintech公司)，NF-κB一抗(美國(guó)Abcam公司)，β-actin一抗、鼠二抗、兔二抗(中杉金橋公司)；白細(xì)胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒[優(yōu)爾生(uscnk)];RT-PCR、qPCR試劑盒(Tiangen公司);佛波酯(美國(guó)Sigma公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及巨核細(xì)胞模型建立 常規(guī)培養(yǎng)K562細(xì)胞，按照前期實(shí)驗(yàn)摸索條件，復(fù)制K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化模型，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期時(shí)，加入佛波酯(DMSO溶解，終濃度為10 ng/mL) 誘導(dǎo)72 h，離心收集誘導(dǎo)后細(xì)胞，培養(yǎng)基重懸，接種于新的培養(yǎng)皿中用于后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)分析 收集誘導(dǎo)前后K562細(xì)胞離心涂片，在光鏡下觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志分子 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)前后K562細(xì)胞CD61和CD41陽(yáng)性血小板百分率。三色流式細(xì)胞分析法詳細(xì)操作步驟參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.4轉(zhuǎn)染佛波酯誘導(dǎo)分化 誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖至80%左右匯合時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。按照轉(zhuǎn)染試劑操作指南操作，分別導(dǎo)入miR-146a mimic、miR-146a inhibitor、mimic-NC、inhibitor-NC等。

1.2.5熒光定量檢測(cè)miR-146a水平 收集細(xì)胞，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA,PCR擴(kuò)增。miR-146a：上游引物5′-TAATCGTGTGAGAACTGAATTC-3′，下游引物5′-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3′；U6：上游引物5′-ATTGGAACGATA CAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCT TCACGAATTTG-3′。具體步驟參照熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)。擴(kuò)增條件：95 ℃ 15 min 1個(gè)循環(huán);95 ℃ 10 s,60 ℃ 32 s 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本均做3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)基因分析。

1.2.6ELISA測(cè)定IL-6、TNF-α水平 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α水平，結(jié)果經(jīng)酶標(biāo)儀讀數(shù)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行定量分析。

1.2.7Western blot檢測(cè)TLR4、NF-κB蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染3 d后的細(xì)胞懸浮液離心(1 000 r/min離心5 min)，PBS洗滌3次；加入50 μL×Loading Buffer漩渦振蕩充分裂解細(xì)胞，置沸水中煮10 min，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂牛奶封閉2 h，雙蒸水洗膜5 min×3次，加入稀釋好的一抗4 ℃搖床孵育36～48 h，TBST洗滌10 min×3次。加入二抗常溫孵育1.5 h，TBST 洗滌10 min ×3次。加入顯影液曝光，以β-actin 作為內(nèi)參照。

1.2.8RT-PCR檢測(cè)NF-κB、IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)水平 收集細(xì)胞，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA,PCR擴(kuò)增。具體步驟參照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)。NF-κB、IRAK1引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 60 s，循環(huán)30次；總延伸72 ℃ 7 min。IRAK1退火溫度56.8 ℃，NF-κB退火溫度 57.8 ℃。

表1 引物系列

1.2.9靶基因預(yù)測(cè) 利用3種常用的靶基因預(yù)測(cè)軟件(TargetScan、PicTar、miRanda)預(yù)測(cè)miR-146a可能作用的靶基因，結(jié)合miR-146a在調(diào)控血小板免疫炎癥過(guò)程中的作用，在預(yù)測(cè)結(jié)果交集中篩選出IRAK1基因?yàn)闈撛诘陌谢?；通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證IRAK1是否含有miR-146a的靶位點(diǎn)；通過(guò)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)miR-146a后細(xì)胞中靶基因mRNA及蛋白表達(dá)的變化，從而確定miR-146a與靶基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)學(xué)變化 K562細(xì)胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞逐漸變形，到72 h時(shí)細(xì)胞變化最明顯，呈現(xiàn)出巨核細(xì)胞特點(diǎn)：細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓形，邊緣不規(guī)則，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，排列緊密，核仁不甚清晰，出現(xiàn)空泡及偽足等，見(jiàn)圖1。

A:誘導(dǎo)0 h；B誘導(dǎo)24 h；C：誘導(dǎo)48 h；D：誘導(dǎo)72 h

圖1 佛波酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞的形態(tài)變化(×100)

2.2表面標(biāo)志物CD41和CD61表達(dá)水平 K562細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)CD41和CD61，而佛波酯誘導(dǎo)72 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD41和CD61的陽(yáng)性率分別高達(dá)38.7%和46.45%，見(jiàn)圖2。

圖2 佛波酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞前后CD41、CD61表達(dá)變化

2.3siRNA轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定 與mimic-NC組相比，miR-146a mimic組miR-146a的表達(dá)明顯升高(約77.5倍)；與inhibitor-NC組相比，miR-146a inhibitor組miR-146a表達(dá)下降(約7.5倍),見(jiàn)圖3。

1：Control；2：miR-146a mimic；3：miR-146a inhibitor；4：mimic-NC；5：inhibitor-NC

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后各組miR-146a水平變化

2.4miR-146a對(duì)IL-6、TNF-α水平的影響 與mimic-NC組相比， miR-146a mimic組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)；與inhibitor-NC組相比，miR-146a inhibitor組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞IL-6、TNF-α水平

a：P<0.05，與Control組比較;b：P<0.05 與mimic-NC組比較;c：P<0.05，與inhibitor-NC組比較

2.5miR-146a對(duì)TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染72 h后提取總蛋白質(zhì)行Western blot，結(jié)果顯示miR-146a mimic組中TLR4蛋白表達(dá)明顯升高，NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。轉(zhuǎn)染48 h后提取總RNA行RT，結(jié)果顯示： miR-146a mimic 可降低NF-κB mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

1：Control；2：miR-146a mimic；3：miR-146a inhibitor；4：mimic-NC；5：inhibitor-NC；a：P<0.05，與Control組比較;b：P<0.05，與miR-146a mimic組比較;c：P<0.05，與miR-146a inhibitor組比較

圖4 各組細(xì)胞TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

1：Control；2：miR-146a mimic；3：miR-146a inhibitor；4：mimic-NC；5：inhibitor-NC；a：P<0.05，與Control組比較;b：P<0.05，與miR-146a mimic組比較;c：P<0.05，與miR-146a inhibitor組比較

圖5 各組細(xì)胞NF-κB mRNA表達(dá)

2.6驗(yàn)證靶基因 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染Pmir-Report-WT-IRAK-1-3′UTR載體與miR-146a mimic，在細(xì)胞內(nèi)miR-146a與IRAK1 3′UTR相結(jié)合，使得載體熒光素酶不表達(dá)，熒光素酶活性受到明顯抑制；而將此共轉(zhuǎn)染體系中更換為mimic-NC或Pmir-Report-MUT-IRAK-1-3′UTR載體，則熒光素酶表達(dá)不受影響，熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖6。hsa-miR-146a可以與IRAK1的3′UTR相結(jié)合，IRAK1是hsa-miR-146a的靶基因。進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明hsa-miR-146a過(guò)表達(dá)能降低IRAK1蛋白表達(dá)而不影響IRAK1 mRNA表達(dá)，阻遏hsa-miR-146a的表達(dá)則提高了IRAK1的蛋白表達(dá)，IRAK1 mRNA表達(dá)也無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖7、8。hsa-miR-146a在轉(zhuǎn)錄后水平抑制IRAK1表達(dá)，再次證實(shí)IRAK1是hsa-miR-146作用的靶基因。

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因交叉轉(zhuǎn)染后對(duì)熒光素酶活性的影響

圖7 各組細(xì)胞IRAK1 mRNA表達(dá)

1：Control；2：miR-146a mimic；3：miR-146a inhibitor；4：mimic-NC；5：inhibitor-NC；a：P<0.05，與Control組比較;b：P<0.05，與miR-146a mimic組比較;c：P<0.05，與miR-146a inhibitor組比較

圖8 各組細(xì)胞IRAK1蛋白表達(dá)

3 討 論

激活的血小板自身能分泌多種炎癥因子，如IL-1β、IL-3、IL-6、TNF-α[10]。此外，血小板激活后通過(guò)與血管內(nèi)皮、循環(huán)中的白細(xì)胞相互作用，釋放多種促炎分子[4,11-12]。因此，血小板的免疫炎性反應(yīng)不僅參與動(dòng)脈粥樣斑塊破裂及血栓形成，還貫穿在動(dòng)脈粥樣硬化的形成及發(fā)展的整個(gè)慢性炎性反應(yīng)過(guò)程中[13-14]。研究血小板的免疫炎性反應(yīng)，對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的預(yù)防和治療有著深遠(yuǎn)意義。然而血小板體外存活時(shí)間短，保存困難，容易激活，體外研究困難。K562細(xì)胞是一種雙分化潛能的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，在國(guó)際上被通用于研究巨核細(xì)胞的分化研究。本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了體外用佛波酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞構(gòu)建巨核細(xì)胞/血小板模型[15]，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-146a siRNA成功上調(diào)或下調(diào)了miR-146a水平。上調(diào)miR-146a表達(dá)后，TLR4蛋白明顯升高，NF-κB mRNA和蛋白降低，細(xì)胞上清IL-6、TNF-α水平明顯降低。下調(diào)miR-146a表達(dá)后，TLR4蛋白明顯降低，NF-κB mRNA和蛋白明顯升高，細(xì)胞上清IL-6、TNF-α水平明顯升高。IRAK1是TLR4/NF-κB信號(hào)通路中的一關(guān)鍵分子,多個(gè)生物信息學(xué)軟件都預(yù)測(cè)到IRAK1是miR-146a的一個(gè)靶基因，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因證明在血小板中miR-146a可以靶向作用于IRAK1，并通過(guò)Western blot和RT-PCR檢測(cè)證明血小板中miR-146a也能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控IRAK1的表達(dá)。從而表明miR-146a可通過(guò)TLR-4/NF-κB炎癥通路抑制血小板的炎性反應(yīng)，并且其可能機(jī)制是通過(guò)作用TLR4/NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵靶點(diǎn)IRAK1，負(fù)性調(diào)節(jié)此通路，減弱該通路下游NF-κB介導(dǎo)的IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。目前研究的miR-146a抗炎的經(jīng)典途徑之一是miR-146a通過(guò)靶向作用于IRAK1、TRAF6，負(fù)向調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路，抑制該通路下游NF-κB介導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)[16-17]。上述經(jīng)典途徑與本研究結(jié)果完全一致。然而，也有研究表明miR-146a可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥，加重冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病[18-19]。因此，需要進(jìn)一步研究miR-146a在血小板免疫炎癥及冠狀動(dòng)脈粥樣性心臟病中的的作用機(jī)制。