血清25(OH)D3、miR-221水平與冠狀動脈病變程度、內(nèi)皮功能的關(guān)系

范迎春，李 鋒，朱孟霞，朱孟允，盧靜海

(1.勝利油田勝利醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東東營 257055;2.山東省臨沂市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 276023;3.山東省臨沂市第三人民醫(yī)院血液科 276023;4.山東省臨沂市臨沭縣人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 276000;5.勝利油田勝利醫(yī)院心內(nèi)科,山東東營 257055)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)又名冠心病，是冠狀動脈發(fā)生動脈粥樣硬化，造成血管腔狹窄甚至阻塞，供血不足引起心肌缺血、缺氧或壞死的慢性炎癥性疾病，是當(dāng)今社會危害生命健康的主要嚴(yán)重疾病之一[1]。冠狀動脈發(fā)生病變一般預(yù)示著CHD的開始，冠狀動脈病變可通過冠狀動脈造影術(shù)檢測手段確診，根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果結(jié)合Gensini積分結(jié)果即可判定冠狀動脈病變程度[2]。而血管內(nèi)皮功能障礙是動脈硬化向嚴(yán)重心血管疾病終點(diǎn)發(fā)展的關(guān)鍵因素，也是CHD的始動因素，血管內(nèi)皮功能障礙可通過外周動脈張力測定(peripheral arterial tension,PAT)技術(shù)計(jì)算反應(yīng)性充血指數(shù)(reactive hyperemia index,RHI)診斷血管內(nèi)皮功能障礙程度[3]。25-羥維生素D3[25(OH)D3]是機(jī)體維生素D營養(yǎng)狀況的檢測指標(biāo)，可直接反應(yīng)機(jī)體維生素D是否缺乏，近年來有研究顯示維生素D與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)越來越多的研究發(fā)現(xiàn)微RNA(microRNA，miRNA)與心血管疾病密切相關(guān)，而miR-221在急性心肌梗死中高表達(dá)，且與心肌肥大、心律失常、心力衰竭及心肌重塑等多種心血管疾病緊密相關(guān)，在動脈粥樣硬化中能抑制血管生成[4]。因此，本研究旨在探究血清25(OH)D3、miR-221水平與冠狀動脈病變程度、內(nèi)皮功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年2月勝利油田勝利醫(yī)院心內(nèi)科收治的CHD并行冠狀動脈造影檢查的患者86例作為CHD組，健康體檢者30例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)冠狀動脈造影確診的CHD患者；(2)受試者自愿參與本研究，并簽署知情同意書；(3)經(jīng)該院倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝腎功能不全者；(2)合并感染性疾病者；(3)合并繼發(fā)性高血壓者；(4)合并心瓣膜疾病者；(5)合并其他器官性心臟病者；(6)合并糖尿病、腦血管及周圍血管栓塞性疾病者；(7)近期有非類固醇類抗炎藥或糖皮質(zhì)激素類使用史者。CHD組男49例，女37例；年齡37～82歲，平均(58.13±9.17)歲；冠狀動脈單支病變23例，雙支病變19例，多支病變44例。對照組男17例，女13例；年齡35～81歲，平均(56.73±8.91)歲。兩組受試者性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2樣本采集 所有受試者清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，3 000 r/min離心5 min，分離血清于無RNA酶管中，置于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3儀器與試劑 25(OH)D3ELISA試劑盒購自英國IDS公司，總RNA提取試劑盒、TaqMan miRNA試劑盒、SYBR Green qPCR Mix 購自美國Applied Biosystems公司，酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR儀(iCycler iQ)購自美國Bio-Rad公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國UVP公司，內(nèi)皮功能檢測儀(ZX7-Endo-pat2000)購自奧德亨醫(yī)療(中國)有限公司，全自動生化分析儀(BeckmanAU5800)購自美國Beckman Coulter有限公司，PCR引物由上海生工公司合成。

1.4檢測方法

1.4.1ELISA檢測25(OH)D3水平 標(biāo)準(zhǔn)品液配制；加血清樣本與標(biāo)準(zhǔn)液混勻；37 ℃溫箱孵育2 h；反復(fù)3次洗滌液沖洗，紙上拍干；加一抗工作液100 μL(除空白孔)，混勻；37 ℃溫箱孵育1 h；洗滌液沖洗3次，吸水紙上拍干；每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素工作液100 μL；37 ℃溫箱孵育30 min；洗滌液沖洗3次，吸水紙上拍干；每孔加底物工作液100 μL混勻，避光，37 ℃溫箱孵育15 min；加終止液100 μL；測定光密度(OD)值：45 nm波長測定OD值。操作步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD值計(jì)算出相應(yīng)血清25(OH)D3水平。

1.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測血清miR-221水平 (1)總RNA提?。簩⒀寮尤霟oRNA酶離心管中，加裂解液，充分混勻裂解，提取步驟按照試劑盒說明書操作，分光光度計(jì)測濃度及純度，RNA純度高，無降解、無DNA污染即可用于cDNA合成。(2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：反應(yīng)體系為RNA模板2.0 μL，RT引物2.0 μL，5×RT Buffer 5.0 μL，dNTP 2.0 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，20 U/μL RT酶0.5 μL，dd H2O 24.0 μL。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。(3)qRT-PCR檢測：以U6做內(nèi)參基因，以反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板，反應(yīng)體系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，cDNA 1 μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)水7 μL，反應(yīng)總體積20 μL，每個(gè)目的基因做3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)條件：94 ℃,5 min；94 ℃ 30 min,59 ℃ 30 s，72 ℃,10 min，30個(gè)循環(huán)。啟動iCycler iQ qRT-PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列

1.4.3內(nèi)皮功能檢測 采用內(nèi)皮功能檢測儀對受試者內(nèi)皮功能進(jìn)行檢測，受試者靜臥30 min以上，左上臂佩戴充氣袖，雙手食指佩戴生物傳感器，打開Endo-pat軟件，待信號穩(wěn)定，記錄3次：記錄5 min指端血管床血流作為基線信號，快速充氣袖帶(>200 mm Hg)，此時(shí)一側(cè)指端血流信號消失，記錄5 min后袖帶快速放氣(0 mm Hg)，指端血流信號恢復(fù)后記錄5 min，結(jié)束檢測。計(jì)算RHI，RHI≥1.67為正常，RHI越小，表示血管內(nèi)皮功能障礙嚴(yán)重。

1.4.4冠狀動脈造影 取橈動脈為入路，左冠狀動脈取6個(gè)體位：左前斜+頭位、左前斜+足位、正頭位、正足位、右前斜+頭位、右前斜+足位；右冠狀動脈至少取3個(gè)體位：左前斜位、右前斜位、頭位。病變程度評估采用Gensini評分系統(tǒng)對冠狀動脈病變狹窄程度進(jìn)行評分[6]，正常記0分，狹窄直徑小于或等于25%記1分，>25%～50%記2分，>50%～75%記4分，>75%～90%記8分，>90%～99%記16分，完全閉塞記32分；參照不同冠狀動脈分支確定系數(shù)，左主干病變×5；左前降支近段×2.5，中段×1.5，遠(yuǎn)段×1.0;對角支病變:第一對角支×1.0，第二對角支×0.5;左回旋支近段×2.5，鈍緣支×1.0，遠(yuǎn)段×1.0，后降支×1.0，后側(cè)支×0.5;右冠狀脈近、中、遠(yuǎn)和后降支均×1。根據(jù)冠狀動脈狹窄積分乘以該病變部位相應(yīng)的系數(shù)，最終乘積即為Gensini積分，評分越高病變越嚴(yán)重。根據(jù)Gensini積分分為高分組26例(>0～<20)，中分組41例(20～<40)，低分組19例(≥40分)。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清25(OH)D3，miR-221水平及RHI比較 CHD組血清25(OH)D3、RHI明顯低于對照組(P<0.05)，miR-221水平明顯高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組血清25(OH)D3，miR-221水平及RHI比較

2.2不同病變程度冠狀動脈血清25(OH)D3、miR-221水平、Gensini積分及RHI比較 高分組、中分組患者血清miR-221水平高于低分組(P<0.05)，且高分組高于中分組(P<0.05)；高分組、中分組患者血清25(OH)D3、RHI低于低分組，高分組低于中分組(P<0.05)，見表3。

2.3CHD患者血清25(OH)D3、miR-221水平與相關(guān)指標(biāo)相關(guān)性分析 通過Pearson相關(guān)性分析顯示，CHD患者血清25(OH)D3、miR-221水平與年齡、血糖、低密度脂蛋白(LDL-C)無相關(guān)性(P>0.05)；25(OH)D3與RHI呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與Gensini積分呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；miR-221與RHI呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與Gensini積分呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表3 不同Gensini積分組血清25(OH)D3、miR-221水平及RHI比較

a：P<0.05，與低分組比較；b：P<0.05，與中分組比較

表4 CHD患者血清25(OH)D3、miR-221水平與相關(guān)指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4CHD患者血清25(OH)D3與miR-221水平相關(guān)性分析 隨著血清25(OH)D3水平降低，miR-221表達(dá)水平呈明顯升高趨勢，25(OH)D3與miR-221表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.725，P=0.000)，見圖1。

圖1 CHD患者血清25(OH)D3與miR-221水平相關(guān)性分析

2.5冠狀動脈病變相關(guān)因素的Logistic回歸分析 以冠狀動脈病變?yōu)橐蜃兞?，年齡、TC、TG、HDL、25(OH)D3、miR-221為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析顯示，年齡、miR-221是影響冠狀動脈病變形成的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，HDL、25(OH)D3是影響冠狀動脈病變形成的保護(hù)因素(P<0.05)，TC、TG與冠狀動脈病變形成無相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

表4 冠狀動脈病變相關(guān)因素的Logistic回歸分析

3 討 論

近年來，隨著國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和飲食習(xí)慣的改變，CHD發(fā)病患者日趨年輕化；并且隨著老齡化人口增多，CHD發(fā)病率和病死率呈逐年遞增趨勢，嚴(yán)重危害生命健康。CHD病理基礎(chǔ)是由于冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷、血漿脂質(zhì)出現(xiàn)沉積、單核細(xì)胞浸潤、血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、泡沫細(xì)胞的形成及凋亡等因素引起粥樣硬化斑塊破裂，隨血液循環(huán)在血管內(nèi)形成不同程度的血栓甚至遠(yuǎn)端血管栓塞，引起冠狀動脈不完全或完全堵塞所致[5-7]。引起冠狀動脈病變的因素眾多復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)維生素D、miRNA與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[8-9]。

維生素D是人體必需的脂溶性維生素之一，大部分來自于皮膚經(jīng)中波紫外線照射在肝臟、腎臟中合成，25(OH)D3在人體內(nèi)水平較高，且穩(wěn)定，半衰期長，能夠較準(zhǔn)確地反應(yīng)體內(nèi)維生素D水平。李南陽等[10]研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者血清25(OH)D3水平顯著降低，其水平變化與冠狀動脈病變程度密切相關(guān)。miR-221屬于miRNA的一種，在多種疾病中都有異常表達(dá)，參與血細(xì)胞生成、血管生成、乳腺發(fā)育、肝癌、胰腺癌、胃癌、宮頸癌等發(fā)育及疾病發(fā)生過程，特別是惡性疾病，且可作為生物標(biāo)記物。MACKENZIE等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-221表達(dá)上調(diào)抑制血管平滑肌細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)器p27kip1，從而介導(dǎo)血管鈣化引起動脈粥樣硬化及狹窄。血管內(nèi)皮功能障礙是冠心病的始動環(huán)節(jié)，導(dǎo)致其產(chǎn)生的主要原因是內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)異常，內(nèi)皮型一氧化氮合酶是內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管重塑的重要因子，同時(shí)其降低還是動脈粥樣硬化和缺血性心肌病患者的特征性標(biāo)志，而miR-221表達(dá)上調(diào)時(shí)可直接降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程[12]。RHI可直接反應(yīng)血管內(nèi)皮功能障礙程度，具有高敏感性，且以自身為參照，有效排除心理、環(huán)境等因素引起的血管變化影響，診斷準(zhǔn)確性高。何珊珊等[13]研究顯示RHI下降與CHD血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，CHD組血清miR-221水平明顯高于對照組，25(OH)D3、RHI明顯低于對照組，這與CHISTIAKOV等[14]和劉曉輝等[15]研究結(jié)果基本一致。說明CHD患者存在血清miR-221水平上調(diào)，RHI降低現(xiàn)象。本研究結(jié)果還顯示，隨著冠狀動脈病變程度越高miR-221表達(dá)水平越高，25(OH)D3、RHI降低越明顯，表明25(OH)D3、miR-221可能參與CHD患者冠狀動脈病變的發(fā)生發(fā)展過程，并可預(yù)測冠狀動脈病變程度。通過Pearson相關(guān)性分析顯示，25(OH)D3與RHI呈顯著正相關(guān)，與Gensini積分呈顯著負(fù)相關(guān)；miR-221與RHI呈顯著負(fù)相關(guān)，與Gensini積分呈顯著正相關(guān)，這與JIA等[16]的研究結(jié)果基本一致。提示25(OH)D3、miR-221可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能參與CHD病程，可通過補(bǔ)充維生素D及降低miR-221表達(dá)水平改善血管內(nèi)皮功能，延緩疾病進(jìn)展及減少并發(fā)癥發(fā)生。這可能是25(OH)D3缺乏時(shí)可刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)向內(nèi)膜遷移，降低血管張力的調(diào)節(jié)功能，而miR-221表達(dá)水平升高降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及內(nèi)皮細(xì)胞黏附，引起細(xì)胞內(nèi)皮功能紊亂所致[17-18]。Logistic回歸分析顯示，年齡、miR-221是影響冠狀動脈病變形成的危險(xiǎn)因素，25(OH)D3、HDL是影響冠狀動脈病變形成的保護(hù)因素。提示對血清25(OH)D3、miR-221水平進(jìn)行早期檢測可作為冠狀動脈病變及內(nèi)皮功能障礙的檢測指標(biāo)，并通過補(bǔ)充維生素D與下調(diào)miR-221水平對冠狀動脈病變及內(nèi)皮功能障礙形成具有一定保護(hù)作用。

綜上所述，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，CHD患者血清25(OH)D3表達(dá)水平降低，與冠狀動脈病變程度呈負(fù)相關(guān)，miR-221表達(dá)水平上調(diào)，與冠狀動脈病變程度呈正相關(guān)，維生素D缺乏越嚴(yán)重及miR-221表達(dá)水平越高，血管內(nèi)皮功能障礙越嚴(yán)重，25(OH)D3、miR-221可能通過對管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)參與冠狀動脈病變的發(fā)生發(fā)展，可作為冠狀動脈病變程度的潛在生物標(biāo)記物。