咖啡因在高氧誘導(dǎo)早產(chǎn)仔鼠肺損傷中的修復(fù)作用研究*

鄧 萌，宋亞楠，程 宇，李 青，張 翔，王 歡，吳凱峰，劉曉麗，鄭興惠，黃 波△

(1.遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院PICU，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學研究生院，貴州遵義 563000)

早產(chǎn)兒出生時肺部發(fā)育不成熟，常需要氧氣支持和機械通氣治療。然而，長期暴露在高氧環(huán)境極易造成氧化應(yīng)激，形成肺纖維化，使肺部發(fā)育遲緩，最終導(dǎo)致支氣管肺發(fā)育不良(BPD)[1]。細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族中重要成員之一，參與基因表達，細胞增殖、凋亡等重要生命過程[2]。大量研究顯示，高氧條件下可以觸發(fā)ERK途徑[3-5]。咖啡因通常用于治療早產(chǎn)兒的呼吸暫停[6-7]，一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)咖啡因在預(yù)防支氣管肺發(fā)育不良(BPD)中有非常重要的功效[8]。然而，咖啡因的肺保護作用機制目前尚不清楚。本研究以早產(chǎn) Wistar 大鼠為研究對象，復(fù)制高氧肺損傷動物模型，觀察咖啡因干預(yù)后肺纖維化情況， ERK的分布及蛋白表達，并分析咖啡因干預(yù)對早產(chǎn)鼠高氧肺損傷修復(fù)的作用及其與MAPKs/ERK信號通路的關(guān)系，以期為臨床指導(dǎo)用藥及綜合治療BPD提供重要的臨床及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康成年Wistar大鼠[揚州大學比較醫(yī)學中心，許可證號：SCXK(蘇)2012-0004]32只，其中雄性8只，雌性24只，體質(zhì)量200～250 g。分為8組，每組雌鼠和雄鼠按3∶1合籠交配，第2天上午8:00查見陰栓記為妊娠第1天，將孕鼠分籠并于妊娠第19天時行剖宮產(chǎn)取出早產(chǎn)鼠。

1.1.2主要試劑 牛血清清蛋白(BSA，德國Roche公司)；抗兔/鼠通用型免疫組織化學試劑盒[Real EnvisionTMHRP (rabbit/mouse)，丹麥Dako公司]；Phospho-p44/42(pErk)兔多克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物及分組 8窩(72只)早產(chǎn)大鼠出生12～24 h內(nèi)聚攏，分配給代母鼠并分為4組，即空氣+9 g/L鹽水組(A+N組)、空氣+咖啡因組(A+C組)、高氧+9 g/L鹽水組(H+N組)、高氧+咖啡因組(H+C組)，每組18只。

1.2.2高氧模型復(fù)制 H+N組和H+C組持續(xù)暴露于高氧中，A+C組和H+C組予腹腔注射咖啡因29 mg·kg-1·d-1，A+N和H+N組每天腹腔注射同等體積的9 g/L鹽水。代母鼠每24小時在4組之間更換1次，以避免氧中毒，同時排除不同組間代母鼠影響。高氧暴露在自制氧箱內(nèi)完成，氧流量5 L/min，連續(xù)檢測氧濃度(CYS-1數(shù)字測氧儀，上海嘉定電子儀器廠)，使氧濃度維持于60%～70%。早產(chǎn)大鼠高氧、空氣暴露14 d，室溫維持在24～25 ℃ ，晝夜各12 h，自由進食進水，每天開箱15 min進行清掃，無水氯化鈣和生石灰吸收水蒸氣和二氧化碳并每天更換。

1.2.3肺組織收集與制備 于早產(chǎn)仔鼠出生后3、7、14 d，各組選取6只進行取材，3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔麻醉大鼠，開胸并結(jié)扎右肺，剪開左心耳，右心室注入含肝素的生理鹽水，直到左心耳流出的液體清亮為止，分離心、肺。

1.2.4肺組織指標檢測 留取左中肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)進行切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學改變。在100倍光鏡下進行輻射狀肺泡計數(shù)(RAC)，每張切片計數(shù)5次，取平均值。肺濕重/干重(W/D)測定：右肺取部分組織稱濕重后置80 ℃溫箱，48 h后稱肺干重，計算肺W/D值。

1.2.5各組肺組織膠原纖維含量檢測 采用Masson染色法，NikonDSRil偏振光顯微鏡下觀察4組仔鼠各時間點的膠原纖維分布情況。每張切片選取5個視野，采用病理圖文分析系統(tǒng)測試陽性細胞倍數(shù)(陽性細胞倍數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。

1.2.6免疫組織化學檢測磷酸化ERK(p-ERK)在肺組織中的分布 脫蠟,水化組織切片，3%H2O2孵育5～10 min，將切片浸于0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)抗原，5%BSA封閉20 min，滴加pERK抗體(1∶250)，4 ℃過夜。滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG，1∶1 000)，37 ℃ 孵育20 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果判定：胞核和(或)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色即為陽性細胞。

1.2.7Western blot檢測肺組織p-ERK蛋白表達水平 各組分別提取肺組織總蛋白，用BCA法進行蛋白質(zhì)定量，再采用Western blot方法檢測肺組織p-ERK蛋白表達水平，經(jīng)發(fā)光、曝光、顯影后分析結(jié)果，內(nèi)參蛋白為β-actin，以蛋白灰度值進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1各組肺組織病理學觀察 A+N組、A+C組3 d時肺泡結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肺泡腔小，肺泡間隔較厚；H+N組、H+C組3 d時可見肺泡內(nèi)少量紅細胞及液體滲出，偶見炎性細胞和肺水腫表現(xiàn)。A+N組、A+C組7 d時肺泡結(jié)構(gòu)逐漸清楚，無液體和炎性滲出，肺泡間隔變薄。H+N組、H+C組7 d時肺泡壁增厚，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)細胞增加，肺泡內(nèi)大量紅細胞及液體滲出，炎性細胞增多。A+N組、A+C組14 d時肺泡結(jié)構(gòu)逐漸清楚，無液體和炎性滲出，肺泡間隔變薄。H+N組、H+C組14 d時炎性滲出減少，肺間質(zhì)增厚并伴隨纖維化，見圖1。

圖1 各組3、7、14 d時肺組織病理結(jié)構(gòu)(HE染色，×200)

圖2 各組3、7、14 d時肺組織p-ERK蛋白分布(Masson染色，×200)

2.2各組肺RAC、W/D、膠原纖維含量比較 第3天，H+N組的RAC較A+C組明顯降低(P<0.05)。H+N組、H+C組的膠原纖維含量與A+N組、A+C組比較明顯提高(P<0.05)，H+N組的膠原纖維含量較H+C組更高(P<0.05)。第7、14天，H+N組、H+C組的RAC、W/D值和膠原纖維含量與A+N組、A+C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，H+N組、H+C組的RAC降低，W/D值和膠原纖維含量增高；與H+C組比較，H+N組RAC更低，W/D值和膠原纖維含量更高(P<0.05)，見表1。

2.3各組肺組織p-ERK蛋白分布 免疫組織化學檢測結(jié)果表明，p-ERK蛋白陽性反應(yīng)產(chǎn)物在細胞質(zhì)表達，為棕黃色顆粒狀。與A+N組、A+C組比較，高氧暴露3、7、14 d時H+N組肺組織p-ERK平均光密度值均增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而H+C組p-ERK平均光密度值較H+N組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2～3。

表1 各組肺組織RAC、W/D值、膠原纖維含量比較

a：P<0.05，與A+N組比較；b：P<0.05，與A+C組比較；c：P<0.05，與H+N組比較

2.4各組肺組織p-ERK蛋白水平 Western blot結(jié)果表明，各組在3個不同的時間段ERK蛋白水平無明顯差異(圖4B)。高氧暴露第3天、第7天和第14天時，p-ERK蛋白水平在H+N組中明顯升高，與A+C組、A+N組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中在第7天水平最高；在高氧暴露第7天和第14天時，H+C組中的p-ERK蛋白水平降低，與H+N組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4C。各組p-ERK/ERK比值與p-ERK蛋白水平情況表現(xiàn)出相同的趨勢，見圖4D。

圖3 各組3、7、14 d時肺組織p-ERK的平均光密度值

A：ERK、P-ERK、β-actin蛋白灰度條帶；B：4組ERK灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；C：4組p-ERK灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；D：4組p-ERK/ERK蛋白相對表達量柱狀圖

圖4 各組ERK和p-ERK蛋白在肺組織中的表達

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，氧療及機械通氣的應(yīng)用使早產(chǎn)兒存活率明顯提升，但過度或高濃度的氧氣治療極易導(dǎo)致BPD發(fā)生。近年來BPD在存活的早產(chǎn)兒中發(fā)生率為60%以上,嚴重影響兒童的生存質(zhì)量甚至導(dǎo)致其死亡。拮抗氧化應(yīng)激，抑制肺組織纖維化被認為是減少BPD發(fā)生的重要因素，因此本研究擬對咖啡因干預(yù)早產(chǎn)鼠高氧肺損傷修復(fù)的作用及機制進行研究。本課題組選用妊娠19 d破宮產(chǎn)仔鼠作為實驗動物，暴露于高氧環(huán)境后，其組織學變化模擬了早產(chǎn)兒的BPD[9]。通過病理切片發(fā)現(xiàn)，A+N組與A+C組中，肺組織隨著時間延長逐漸發(fā)育；高氧暴露7 d時，H+N組肺泡壁增厚，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)細胞增加，肺泡內(nèi)大量紅細胞及液體滲出，炎性細胞增多，隨著高氧暴露時間的延長，H+N組肺間質(zhì)增厚并伴隨纖維化；咖啡因干預(yù)后，這一現(xiàn)象得以緩解。這與譚利平等[10]研究相符。

咖啡因是一種非選擇性的磷酸二酯酶(PDE)抑制劑，其在治療預(yù)防BPD中的益處是近幾年才被學界所發(fā)現(xiàn)的[11-12]。JING等[13]研究證實咖啡因通過改變?nèi)姿狲B苷環(huán)化水解酶(GCH1)和四氫生物蝶呤(BH4)水平，進而改善內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)活性來保護新生仔鼠未成熟的肺免于高氧誘導(dǎo)的損傷。在家兔建立的高氧肺損傷模型中，也證實了咖啡因可減少肺部功能性和炎性改變[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高氧暴露可導(dǎo)致仔鼠肺組織中RAC降低，W/D值與膠原纖維含量增加，而咖啡因干預(yù)后可明顯抑制這些現(xiàn)象，這充分說明高氧暴露可增加早產(chǎn)仔鼠肺部炎性反應(yīng)和肺組織纖維化，使肺發(fā)育受阻，咖啡因干預(yù)后炎性反應(yīng)和肺組織纖維化程度減輕。

MAPKs是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的中間體，包括ERK、c-Jun、P38和ERK5 4種不同級聯(lián)反應(yīng)，ERK作為其重要成員廣泛參與細胞生長、增殖、分化、應(yīng)激反應(yīng)和細胞凋亡。高氧刺激可以激活ERK，這種現(xiàn)象通常歸因于細胞活性氧(ROS)生成[15]。LI等[16]利用吉非替尼抑制ERK激酶磷酸化拮抗博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，說明ERK信號通路激活可以使肺組織纖維化。因此，能否抑制ERK信號通路的激活成為拮抗高氧誘導(dǎo)肺損傷的關(guān)鍵因素。本實驗通過免疫組織化學和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，高氧暴露后p-ERK水平明顯升高，咖啡因干預(yù)使p-ERK水平降低，說明高氧暴露使ERK信號通路激活，而咖啡因可以抑制這一現(xiàn)象。綜合病理切片、RAC、W/D值和膠原纖維含量結(jié)果，本研究認為高氧暴露后，ERK信號通路被激活，導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)炎性反應(yīng)，肺纖維化程度增加；咖啡因干預(yù)后，通過降低p-ERK水平，抑制ERK信號通路激活，從而抑制肺組織纖維化來行使在早產(chǎn)仔鼠高氧肺損傷時的保護作用。

本研究雖然明確了咖啡因可通過抑制ERK信號通路的激活以起到在高氧肺損傷中的保護作用，但并未探討咖啡因是通過何種途徑對p-ERK水平產(chǎn)生影響。在今后的工作中，本課題組將著重探討咖啡因影響ERK信號通路行使保護作用的具體機制，為臨床防治BPD提供更多理論依據(jù)。