海洋源蛋白酶產(chǎn)生菌篩選及酶學(xué)特性的初步研究

曹 紅，王秀娟，翁佩芳*，周小敏，高志中，吳祖芳，張 鑫

（1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211；2.浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司，浙江 舟山 316100）

傳統(tǒng)的魚(yú)醬油是自然溫度下通過(guò)耐鹽微生物和魚(yú)體自身所含的酶對(duì)原料魚(yú)中的蛋白質(zhì)、脂肪等成分進(jìn)行發(fā)酵分解，形成氣味濃郁、滋味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富的發(fā)酵液[1-2]，包括其中的微生物產(chǎn)生的蛋白酶降解蛋白質(zhì)形成多肽、氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)[3-4]。但是傳統(tǒng)的魚(yú)醬油生產(chǎn)鹽度過(guò)高，生產(chǎn)周期長(zhǎng)達(dá)數(shù)月乃至數(shù)年，產(chǎn)量難以提高；另一方面，自然發(fā)酵過(guò)程中菌群復(fù)雜，特征風(fēng)味物質(zhì)不穩(wěn)定，進(jìn)行速釀工藝研究是魚(yú)醬油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然要求[5]。目前速釀工藝主要依靠超高壓水解、外加酶發(fā)酵、外加曲發(fā)酵和加酸減鹽等快速發(fā)酵方法[6]，但是這些方法均存在一定的局限性，如超高壓水解法操作要求較高，不容易達(dá)到產(chǎn)業(yè)化規(guī)模[7]；外加酶發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生苦味膚，影響風(fēng)味[8]；外加曲發(fā)酵需要在發(fā)酵初期加足鹽量，防止魚(yú)體腐爛，但由過(guò)高的鹽濃度抑制了種曲與魚(yú)體內(nèi)臟酶活力，生產(chǎn)周期沒(méi)有明顯縮短[9]；加酸減鹽發(fā)酵雖可促進(jìn)魚(yú)肉的自溶并縮短發(fā)酵時(shí)間，但是所得魚(yú)露口感偏酸，不符合人們的飲食習(xí)慣[10]。

近幾年國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)魚(yú)醬油發(fā)酵過(guò)程中微生物分解蛋白質(zhì)對(duì)產(chǎn)品影響機(jī)理的研究[11-12]，進(jìn)一步證明利用產(chǎn)蛋白酶微生物菌株作為發(fā)酵劑可改善產(chǎn)品品質(zhì)和縮短發(fā)酵周期。文獻(xiàn) [11]將T.halophilus接種至魚(yú)肉湯中，發(fā)現(xiàn)其風(fēng)味物質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與自然發(fā)酵魚(yú)醬油中的基本一致。文獻(xiàn)[5，13]均發(fā)現(xiàn)將嗜鹽古生菌接種到魚(yú)露發(fā)酵中，不僅縮短魚(yú)露發(fā)酵周期，并且達(dá)到了去腥、防腐的效果，避免不良風(fēng)味的產(chǎn)生。因此外加產(chǎn)蛋白酶微生物法，為魚(yú)露的速釀工藝及產(chǎn)品品質(zhì)改善提供了一種新的解決途徑。

本課題組在前期分析了魷魚(yú)魚(yú)醬油自然發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性及幾種魚(yú)醬油的品質(zhì)比較分析，期望從海洋源的原料中直接篩選出產(chǎn)蛋白酶微生物應(yīng)用于魚(yú)醬油發(fā)酵生產(chǎn)。魚(yú)醬油的原料主要為海洋低值魚(yú)類(lèi)，其體內(nèi)本身就存在大量產(chǎn)蛋白酶微生物，可以直接從其體內(nèi)篩選。魷魚(yú)及其副產(chǎn)物常作為魚(yú)醬油發(fā)酵的原料，且魷魚(yú)蛋白質(zhì)含量高，體內(nèi)菌群分布廣泛，其優(yōu)勢(shì)菌群為假單胞菌、芽孢桿菌等產(chǎn)蛋白酶的微生物[14]。但針對(duì)應(yīng)用魚(yú)醬油發(fā)酵的產(chǎn)蛋白酶微生物的研究較少，本文通過(guò)從海洋源魷魚(yú)分離篩選出高產(chǎn)蛋白酶菌株，旨在為魚(yú)醬油的速釀工藝及品質(zhì)改善提供微生物來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

材料：從寧波路林市場(chǎng)采購(gòu)新鮮的魷魚(yú)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：福林酚試劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；L-酪氨酸 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit（大連寶生物工程有限公司）。

培養(yǎng)基：脂牛奶固體培養(yǎng)基（g/L）：脫脂奶粉75 g，105℃下滅菌 15 min，瓊脂15 g，121℃下滅菌15 min，將兩者在無(wú)菌環(huán)境下混合；干酪素固體培養(yǎng)基（g/L）：A 液：Na2HPO4·12H2O 1.07 g，干酪素 4 g，200 mL水溶解，70℃下水浴 2 h；B 液：KH2PO43 g，200 mL水溶解；A、B液混合后加入瓊脂15 g，定容至1 000 mL，121℃下滅菌15 min；液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化鈉 5 g，121 ℃下滅菌 15 min；斜面保藏培養(yǎng)（g/L）：蛋白胨 10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，121℃下滅菌15 min。

1.2 儀器

QYC-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 （寧波江南儀器廠）；HWS智能型恒溫培養(yǎng)箱 （寧波江南儀器廠）；LV-3300分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；5804R高速冷凍離心機(jī) （德國(guó)Eppendorf公司）；5814R小型高速離心機(jī) （德國(guó)Eppendorf公司）；5331 PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）；Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理將新鮮的魷魚(yú)采用無(wú)菌操作分離魚(yú)皮、內(nèi)臟，并用整魚(yú)作對(duì)照，用滅菌的組織絞碎機(jī)絞碎后，用無(wú)菌生理鹽水浸泡沖洗并收集洗液到無(wú)菌離心管中，此為樣品原液。

1.3.2 高產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩取1 mL樣品原液制備成10-1、10-2和10-33個(gè)梯度菌懸液，分別取200 μL菌懸液涂布于脫脂牛奶固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行，于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，選取菌落周?chē)哂忻黠@透明圈的菌株，于脫脂牛奶固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純培養(yǎng)。

將上述純化的菌株用接種環(huán)點(diǎn)種在干酪素固體培養(yǎng)基上，每株菌株設(shè)3個(gè)平行，于30℃恒溫下培養(yǎng)3 d，挑選能夠產(chǎn)生較大透明圈的菌株，并記錄其透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），比較D/d值，選擇D/d＞2的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.3 高產(chǎn)蛋白酶菌株的復(fù)篩挑取初篩得到的菌株，接種到50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床中，30℃、150 r/min活化24 h，作為種子液，再以4%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min 培養(yǎng) 3 d，取發(fā)酵液，離心（6 000 r/min，15 min，4℃）收集上清液，上清液即為粗酶液，測(cè)定粗酶液蛋白酶活力。篩選出酶活力較高的菌株即為代表菌株，其中酶活力最高菌株即為目的菌株。

1.4 蛋白酶活力的測(cè)定

采用福林酚法（GB/T 23527—2009）測(cè)定蛋白酶活力。

1.5 代表菌株的鑒定

1.5.1 目的菌株形態(tài)及生理生化鑒定菌落形態(tài)觀察：將目的菌株劃線接種于牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)特征和革蘭氏染色特征。

生理生化試驗(yàn)：參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，對(duì)目的菌株進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)。

1.5.2 代表菌株16S rRNA鑒定使用細(xì)菌DNA試劑盒E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit提取分離純化出的代表菌株DNA，以提取出的細(xì)菌DNA為模板，采用通用引物序列 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 1492R （5'-TACGGCTA CCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增菌株的16S rRNA基因[15]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系包括：上下游引物（10 umol/L）各 2 μL，模板 DNA 2 μL，Taq 酶 25 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：（1）95℃預(yù)變性 3 min；（2）94 ℃變性 50 s，52 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 90 s，30個(gè)循環(huán)；（3）72 ℃延伸 10 min。

1.5.3 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析將經(jīng)電泳檢測(cè)擴(kuò)增良好的PCR產(chǎn)物，送往上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所用引物與PCR擴(kuò)增引物相同。測(cè)序所得序列使用BLAST程序，通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較分析。依據(jù)序列分析結(jié)果，選擇與目的菌株序列相似性較高（99%以上）的已知菌株序列，利用MEGA5.05[16]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 粗蛋白酶特性研究

1.6.1 pH對(duì)粗蛋白酶活的影響分別配制pH為3.0～11.0的梯度緩沖溶液，以1%酪蛋白溶液作為粗酶活測(cè)定的反應(yīng)底物，以最高點(diǎn)的粗蛋白酶活力為100%，其他與之相比得相對(duì)酶活力，繪制粗蛋白酶的最適pH值曲線。

1.6.2 pH穩(wěn)定性研究將粗蛋白酶液分別與不同pH的緩沖溶液混合均勻，置于40℃下水浴保溫1 h后，測(cè)定剩余酶活，以最高點(diǎn)粗蛋白酶活力為100%，其他pH條件下與之相比為相對(duì)酶活，繪制粗蛋白酶的pH值穩(wěn)定性曲線，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.6.3 溫度對(duì)粗蛋白酶活的影響在溫度分別為4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃下 測(cè) 定 該菌株粗蛋白酶液酶活，其他條件不變，以最高點(diǎn)粗蛋白酶活力為100%，其他與之相比得相對(duì)酶活，以確定粗蛋白酶的最適反應(yīng)溫度，繪制酶催化溫度曲線，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.6.4 熱穩(wěn)定性研究在35、40、45℃不同溫度條件下，將粗蛋白酶液置分別保溫一定時(shí)間，取出后迅速冷卻，以pH 7.2的1%酪蛋白溶液為反應(yīng)底物，40℃下測(cè)定剩余粗蛋白酶活力，以未處理的粗蛋白酶液的酶活為100%，其他溫度條件下與之相比為相對(duì)酶活，繪制酶熱穩(wěn)定性曲線，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.6.5 金屬離子對(duì)酶活的影響向反應(yīng)體系中加入終濃度為 1 mmol/L不同金屬離子：Ca2+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Ba2+、Mn2+，充分混勻后，在 40 ℃下放置24 h，測(cè)定酶活，以超純水為空白對(duì)照的粗蛋白酶液的酶活力為100%，其他金屬離子下與之相比為相對(duì)酶活，計(jì)算相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

2.1.1 高產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩從脫脂牛奶平板培養(yǎng)基上挑取具有明顯透明圈的菌株，接種在干酪素平板分離培養(yǎng)上，篩選透明圈D/d＞2的菌株，透明圈結(jié)果如圖1所示。分別從魷魚(yú)魚(yú)皮、內(nèi)臟、整魚(yú)（分別記為SE、SV、SW，下同）中分離得到5株、4株、7株產(chǎn)蛋白酶菌株。由此看出，產(chǎn)蛋白酶菌株在魷魚(yú)不同部位的數(shù)量無(wú)明顯差異，這表明在魷魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)蛋白酶菌株分布較均勻。一般來(lái)講，新鮮捕獲的健康魷魚(yú)其組織內(nèi)部是無(wú)菌的，然而在魚(yú)表面的黏液及內(nèi)臟內(nèi)存在微生物，這主要是魷魚(yú)蛋白質(zhì)含量豐富利于微生物的寄生[17]。

圖1 產(chǎn)蛋白酶菌株在脫脂牛奶平板培養(yǎng)基Fig.1 Transparent circles on skim-milk culture

2.1.2 高產(chǎn)蛋白酶菌株的復(fù)篩將上述初篩得到的16株產(chǎn)蛋白酶菌株發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液的蛋白酶活力。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=0.010 3x-0.006 8（R2=0.999 7，0＜x＜100 ug/mL），根據(jù)酶活力公式計(jì)算各菌株產(chǎn)酶能力。復(fù)篩結(jié)果如表1所示，由表1可以看出SW5產(chǎn)酶活性最高為257.67±2.44 U/mL，對(duì)比文獻(xiàn)[18]從南海深海海泥中篩選出的產(chǎn)蛋白酶菌株蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）酶活力為90 U/mL提高近3倍，并將SW5菌株作為目的菌株，進(jìn)一步做產(chǎn)酶特性研究，將表1中所有菌株作為代表菌株，進(jìn)行菌株鑒定。

2.2 代表菌株鑒定

將上述復(fù)篩得到的10株菌株，革蘭氏染色觀察。以細(xì)菌通用引物27F和1492R對(duì)代表菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均得到重復(fù)性好且穩(wěn)定、清晰的特異性條帶，片段大小為1200 bp左右，電泳圖譜如圖2所示。再將測(cè)序后的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，所得結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明篩選出的菌株可以分為3類(lèi)：芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、普羅威登斯菌屬（Providenciasp.）、假單胞菌屬 （Pseudomonassp.），且置信度≥98%，其中解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）較多。目的菌株SW5為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus），置信度為 100%。研究發(fā)現(xiàn)魷魚(yú)中產(chǎn)蛋白酶的微生物主要為芽孢桿菌屬和假單胞菌屬[19-20]。芽孢桿菌產(chǎn)生蛋白酶能力較強(qiáng)，是常見(jiàn)的商業(yè)產(chǎn)蛋白酶菌株，有學(xué)者對(duì)芽孢桿菌所產(chǎn)的蛋白酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)此類(lèi)菌具有較高的酶活力，可能是通過(guò)產(chǎn)生蛋白酶降解蛋白質(zhì)[21]。魷魚(yú)中的優(yōu)勢(shì)菌群主要為假單胞菌，假單胞菌大多耐低溫，分泌的蛋白酶卻耐高溫，即使經(jīng)過(guò)高溫處理后，在食品中仍然能檢測(cè)到這種酶的存在，在低溫儲(chǔ)藏條件下，殘留的蛋白酶也可以繼續(xù)分解蛋白質(zhì)[22]。國(guó)內(nèi)對(duì)普羅威登斯菌的報(bào)道較少，一般在肉類(lèi)食品中容易檢測(cè)到，是動(dòng)物腸道的正常菌群，同樣對(duì)蛋白質(zhì)具有分解作用[23]。

表1 產(chǎn)蛋白酶菌株復(fù)篩結(jié)果Table 1 Results of the screening protease producing strain

圖2 菌株DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Electrophoregram of PCR amplification products of strains'DNA

表2 代表菌株鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of the representative strains

2.3 目的菌株SW5鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)建立

菌株SW5革蘭氏染色為陽(yáng)性，芽孢染色陽(yáng)性，生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù) 《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中芽孢桿菌屬的特征描述，可以確定菌株SW5屬于芽孢桿菌屬。將SW5的16S rRNA序列提交NCBI，在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較分析，選取同源性在99%以上的菌株的序列，用Mega5.05軟件進(jìn)行序列對(duì)比，建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。從圖3可以看出，SW5菌株與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicusKC790303.1）同源性最高，可達(dá)100%。由此可以推斷出高產(chǎn)蛋白酶菌株SW5為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌。研究報(bào)道甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)、分布廣，存在于土壤、水、及動(dòng)物腸道等處[24]。張巖等從合浦珠母貝黏液中同樣分離得到一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其蛋白酶的酶解發(fā)酵液具有抑菌作用，可作為天然防腐劑的開(kāi)發(fā)，其抑菌成分為蛋白或多肽類(lèi)物質(zhì)[25]。楊佳等從肖爾布拉克酒業(yè)醬香型高溫大曲中分離得到的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌不僅產(chǎn)蛋白酶活力高，而且能夠發(fā)酵產(chǎn)生香氣物質(zhì)，調(diào)節(jié)食品風(fēng)味[26]。

2.4 粗蛋白酶特性分析

2.4.1 粗蛋白酶的最適pH及其酸堿穩(wěn)定性測(cè)定不同pH對(duì)粗蛋白酶活性的影響，結(jié)果如圖4所示，pH在3～8時(shí)，SW5菌株所產(chǎn)粗蛋白酶的酶活力隨pH增加逐漸升高，pH為8.0時(shí)，粗酶活力達(dá)到最高，若繼續(xù)pH升高，則粗酶活力逐漸下降，由此看出該菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適pH為6.0～8.0。黃紫燕研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)醬油發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌所產(chǎn)蛋白酶的最適pH為7.0，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其報(bào)道一致，發(fā)酵液的pH與魚(yú)露的各項(xiàng)理化指標(biāo)及風(fēng)味密切相關(guān)[27]。蛋白酶在魚(yú)醬油發(fā)酵過(guò)程中的主要作用是不斷把魚(yú)肉蛋白分解成小分子的肽或游離氨基酸，進(jìn)而影響發(fā)酵液pH及風(fēng)味[28]。

表3 SW5菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of SW5

圖3 菌株SW5的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain SW5

SW5菌株所產(chǎn)粗蛋白酶對(duì)pH的穩(wěn)定性如圖5所示，pH為8.0～10.0時(shí)，該粗蛋白酶的穩(wěn)定性較好，均已達(dá)到85%以上；但當(dāng)反應(yīng)體系為酸性條件時(shí)，粗酶活力損失比較嚴(yán)重，因此可以判斷該菌株所產(chǎn)粗蛋白酶在堿性條件下能夠發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)作用。

2.4.2 粗蛋白酶的最適溫度及其熱穩(wěn)定性測(cè)定SW5菌株所產(chǎn)粗蛋白酶在不同溫度條件下的酶活性，結(jié)果如圖6所示，由圖可知當(dāng)溫度較低時(shí)，粗蛋白酶活力隨溫度的升高而逐漸增大，當(dāng)溫度升高到40℃時(shí)，該粗蛋白酶活力達(dá)到了最高，在30～50℃時(shí)具有較高酶活性。當(dāng)溫度低于30℃或高于50℃時(shí)，粗蛋白酶活力均會(huì)顯著下降。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)醬油發(fā)酵的溫度一般在30～45℃[29]，張豪等研究了魚(yú)醬油曲的制備工藝，當(dāng)發(fā)酵溫度為37℃時(shí)得到的魚(yú)醬油具有固有香型，達(dá)到了速釀的目的[30]。因此，該菌株所產(chǎn)的蛋白酶可以作為外源酶添加到魚(yú)醬油發(fā)酵中，為魚(yú)醬油發(fā)酵提供一種新的參考。

圖4 pH對(duì)粗蛋白酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on crude protease activity

圖5 pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability

SW5菌株所產(chǎn)粗蛋白酶對(duì)溫度的穩(wěn)定性如圖7所示，若保溫相同時(shí)間，隨溫度的升高，粗蛋白酶活性逐漸降低；在35℃下，保溫不同時(shí)間測(cè)定粗蛋白酶活性，保溫60 min后仍保留80%以上的酶活性，相對(duì)穩(wěn)定；當(dāng)溫度為55℃時(shí)，保溫30 min后粗蛋白酶活力損失了25%，保溫60 min后，粗蛋白酶活力僅剩余60%。由此可知，該蛋白酶在35℃擁有良好的穩(wěn)定性。

2.4.3 金屬離子對(duì)粗蛋白酶活力的影響測(cè)定不同金屬離子對(duì)SW5菌株所產(chǎn)粗蛋白酶活性的影響，金屬離子濃度均設(shè)為1 mmol/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，Mn2+、Ba2+和Ca2+對(duì)該菌株所產(chǎn)粗蛋白酶的酶活力均有較高的激活作用，其中Mn2+的激活作用最大，F(xiàn)e2+和Zn2+對(duì)粗蛋白酶活性有明顯抑制作用。

圖6 溫度對(duì)粗蛋白酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature on crude protease activity

圖7 熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability

圖8 金屬離子對(duì)粗蛋白酶活性的影響Fig.8 Effect of metal ions on crude protease activity

3 結(jié)語(yǔ)

本研究從魷魚(yú)中分離篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株，通過(guò)脫脂牛奶平板培養(yǎng)基和干酪素平板培養(yǎng)基初篩得到16株產(chǎn)蛋白酶菌株，結(jié)合福林酚法測(cè)定菌株的產(chǎn)蛋白酶活力，復(fù)篩得到10株產(chǎn)酶活力較高的代表菌株。經(jīng)PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)代表菌株屬于芽孢桿菌屬 （Bacillussp.）、普羅威登斯菌屬（Providenciasp.）、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）。其中以 SW5 菌株產(chǎn)蛋白酶活力最高，粗酶活力可達(dá)257.67 U/mL，經(jīng)鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicusKC790303.1）。對(duì)SW5菌株的產(chǎn)酶特性進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)粗蛋白酶的最適pH為6.0～8.0，在 pH 8.0～10.0 時(shí)酶較穩(wěn)定；最適溫度為40℃，在30～50℃時(shí)具有較高酶活性，在35℃下保溫60 min后，仍保留80%以上的活性；金屬離子試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終離子濃度為1 mmol/L時(shí)Mn2+、Ba2+和Ca2+對(duì)該菌株所產(chǎn)蛋白酶的酶活力均有較高的激活作用，F(xiàn)e2+和Zn2+對(duì)其有明顯抑制作用。魚(yú)醬油發(fā)酵的溫度為40±5℃，該菌株所產(chǎn)蛋白酶能夠適應(yīng)其發(fā)酵溫度，可以作為外源酶添加到魚(yú)醬油發(fā)酵中，通過(guò)分解魚(yú)肉蛋白影響其發(fā)酵液pH及風(fēng)味，為魚(yú)醬油發(fā)酵提供一種新的蛋白酶來(lái)源。