Cider Beer關(guān)鍵釀造工藝的研究

張 箐 ，劉春鳳 ，鄭飛云 ， 李永仙 ，王金晶 ，李 崎 *

（1.江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

蘋果中富含多種酚類物質(zhì)，包括類黃酮、原花色素[1]和酚酸類物質(zhì)，可以有效預(yù)防癌癥、心臟病[2]、糖尿病[3]等心血管疾病，并有抑制人體衰老、抗腫瘤等功效。蘋果作為我國(guó)第一大果品，大多以鮮食為主，占蘋果總量的80%以上[4]；而蘋果的深加工主要為蘋果濃縮汁加工業(yè)，目前也出現(xiàn)嚴(yán)重的產(chǎn)能過(guò)剩，蘋果二、三級(jí)深加工是限制蘋果加工產(chǎn)業(yè)提高附加值的主要因素[5]?？茖W(xué)研究表明啤酒中約含有17種氨基酸，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，適量飲用啤酒有助于人體健康[6-7]。根據(jù)“2015中國(guó)啤酒業(yè)年度高峰論壇”報(bào)告顯示，我國(guó)啤酒在持續(xù)發(fā)展的情況下，2014年啤酒行業(yè)產(chǎn)量為4 921.9萬(wàn)千升，出現(xiàn)了24年以來(lái)的首次負(fù)增長(zhǎng)，預(yù)示著啤酒行業(yè)進(jìn)入發(fā)展成熟期[7]。啤酒企業(yè)將從產(chǎn)品差異化、產(chǎn)品品質(zhì)化和產(chǎn)品高端化等方面發(fā)力，滿足啤酒市場(chǎng)“低酒精、果味型、低濃度、功能型”的發(fā)展趨勢(shì)。

目前，國(guó)際上Cider Beer的釀造工藝主要有3種：1）果味型，通過(guò)在啤酒中添加香精、檸檬酸等香料制成，其果香非天然發(fā)酵型香氣；2）勾兌型，把啤酒與蘋果汁以不同比例勾兌制成，這種方法制得的產(chǎn)品穩(wěn)定性差，較難推廣；3）發(fā)酵型，是以蘋果汁為主要原料，通過(guò)發(fā)酵和調(diào)配等方法釀造蘋果啤酒，在國(guó)際市場(chǎng)上比例逐漸提高。

本研究選取蘋果汁為原料，以貧氮條件下具有良好增殖能力和發(fā)酵能力的啤酒酵母為發(fā)酵菌株，同時(shí)結(jié)合啤酒釀造工藝研制而成。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵工藝條件，利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出產(chǎn)品較佳的發(fā)酵條件，為進(jìn)一步大批量工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。開展此研究，將有助于促進(jìn)蘋果深加工，提高蘋果產(chǎn)業(yè)附加值，豐富飲料酒市場(chǎng)品類，加強(qiáng)啤酒市場(chǎng)的活躍度，具有很高的實(shí)用價(jià)值[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：10種不同品牌市售不含防腐劑的天然濃縮蘋果汁，6種不同品種市售蘋果，酒花 （青島大花），3 株啤酒酵母 （Q-03、D-8、C-05 分別編號(hào)為A、B、C）為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

試劑：果糖、酒石酸鉀鈉、碘酸鉀、氫氧化鈉、硫酸銅、甘氨酸、亞鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀等試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司，分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；生化培養(yǎng)箱BSP-250，上海博迅公司；阿貝折光儀，泰光有限公司；Kjeltec TM 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS公司；低溫水浴槽，上海博迅公司；UV-2000分光光度計(jì)，F(xiàn)OSS公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制作工藝濃縮蘋果汁→稀釋→調(diào)整pH→添加酒花→滅菌、冷卻→接菌發(fā)酵→過(guò)濾→Cider Beer成品。

1.3.2 蘋果汁的制備蘋果汁可以通過(guò)濃縮蘋果汁稀釋和蘋果榨汁后過(guò)濾兩種方式獲得。

1.3.3 常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)總氮（凱氏定氮法）、α-氨基氮、游離氨基酸和多酚采用ASBC分析方法進(jìn)行檢測(cè)[9]。原麥汁質(zhì)量濃度（密度瓶法）、還原糖（菲林試劑）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（密度瓶法）、總酸（電位滴定法）采用國(guó)標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)[10]。

1.3.4 蘋果汁糖組分檢測(cè)采用高效液相色譜法（HPLC），具體檢測(cè)條件為：色譜柱：Xbridge Amide色譜柱 （3.5 μm，4.6 mm × 250 mm i.d.）。 流速 1.0 mL/min；柱溫35℃；載氣壓力350 kPa；漂移管溫度50℃；增益 6。

1.3.5 發(fā)酵菌株的選擇

1）貧氮條件下菌株增殖能力檢測(cè)。取初始糖度為10%的純蘋果汁制作固體培養(yǎng)基，取5 μL菌液，分別以 1×105個(gè)/mL、1×104個(gè)/mL、1×103個(gè)/mL 菌濃，在培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落涂布培養(yǎng)，并隨時(shí)間記錄平板菌落個(gè)數(shù)。

2）貧氮條件下菌株發(fā)酵能力檢測(cè)。利用發(fā)酵菌株在10%的蘋果汁中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過(guò)CO2失重法記錄每天失重量；主酵結(jié)束后檢測(cè)殘?zhí)呛挺?氨基氮的質(zhì)量濃度，并計(jì)算其利用率。

1.3.6 發(fā)酵取酵母泥接種于無(wú)菌蘋果汁中，用滅菌后的發(fā)酵栓將瓶口密封，11℃下發(fā)酵，每24 h搖瓶一次排出CO2后稱重，主酵結(jié)束后過(guò)濾發(fā)酵液，低溫保存待測(cè)。

1.3.7 單因素實(shí)驗(yàn)選用較佳的蘋果汁原料和較佳的酵母菌株，在其他條件相同的情況下，采用不同的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和酵母接種量用“1.3.6”進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以“1.3.9”為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官品評(píng)，逐個(gè)考察各發(fā)酵條件對(duì)感官品評(píng)的影響，確定每一因素的最佳水平。

1.3.8 正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)“1.3.7”單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和酵母接種量3個(gè)因素，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，以感官評(píng)價(jià)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（見表1）。

1.3.9 感官品評(píng)該研究組織本校經(jīng)過(guò)感覺品評(píng)培訓(xùn)的老師及學(xué)生共40位，由品評(píng)小組打分（見表1）。

表1 Cider Beer感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 Sensory evaluation criteria of Cider Beer

2.1 蘋果汁原料的選擇

在酵母增殖和發(fā)酵的前期，α-氨基氮是酵母所利用的重要氮源。啤酒酵母對(duì)α-氨基氮的質(zhì)量濃度要求在160 mg/L左右，質(zhì)量濃度過(guò)低會(huì)影響酵母的增殖和發(fā)酵[11-12]。針對(duì)不同來(lái)源的蘋果汁，檢測(cè)其還原糖和α-氨基氮質(zhì)量濃度，結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，蘋果汁中α-氨基氮遠(yuǎn)低于普通啤酒酵母對(duì)其要求，在相同條件下，濃縮蘋果汁的α-氨基氮質(zhì)量濃度普遍高于鮮榨蘋果汁的α-氨基氮質(zhì)量濃度，這可能與蘋果榨汁不徹底、過(guò)濾損失有關(guān)。剛榨出的蘋果汁中，含有大量的多糖、果膠和果皮果肉等固形物，會(huì)影響果汁的穩(wěn)定性、阻礙酒液的澄清并且影響成品酒的風(fēng)味和口感[13-14]，樣品7在α-氨基氮質(zhì)量濃度上最高，進(jìn)一步檢測(cè)其糖組分，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

由表3可知，蘋果汁中主要糖為果糖（64%）和葡萄糖 （33%），符合啤酒酵母發(fā)酵對(duì)糖的需求；另外，從產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)的角度考慮，以濃縮蘋果汁作為原料有利于原料的長(zhǎng)久儲(chǔ)存和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸。綜上，本實(shí)驗(yàn)選取樣品7為釀制Cider Beer的原料。

表2 濃縮蘋果汁成分分析Table 2 Analysis of components in concentrated apple juice

表3 樣品7糖組分分析表Table 3 Analysis of carbohydrate components in concentrated apple juice 7

2.2 酵母菌株對(duì)Cider Beer發(fā)酵的影響

釀酒酵母是影響啤酒品質(zhì)的重要因素之一，不同的酵母菌株有著不同的生理特性，其代謝副產(chǎn)物的種類及質(zhì)量濃度不同會(huì)造成酒體風(fēng)味和感官的差別，直接影響啤酒的質(zhì)量[15]。

2.2.1 貧氮條件下菌株增殖能力檢測(cè)選取在貧氮條件下生長(zhǎng)狀況較強(qiáng)的A、B和C菌株，通過(guò)固體培養(yǎng)基上涂布菌落計(jì)數(shù)的方式，對(duì)比3種酵母菌株的增殖能力，見表4?？砂l(fā)現(xiàn)，B和C兩株菌更適應(yīng)純蘋果汁的貧氮環(huán)境，增殖速度快，且增殖能力強(qiáng)。

2.2.2 貧氮條件下菌株發(fā)酵能力檢測(cè)當(dāng)發(fā)酵溫度為11℃，酵母接種量為1×107個(gè)/mL，選取A、B和C三株菌，在初始糖度為10%的純蘋果汁中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，記錄每天CO2失重情況，主酵結(jié)束后對(duì)還原糖和α-氨基氮等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。具體發(fā)酵失重情況如圖1所示，對(duì)應(yīng)理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表5。

表4 不同酵母在蘋果汁固體培養(yǎng)基上的涂布生長(zhǎng)情況Table 4 Coating growth situation of yeast on solid medium

圖1 酵母發(fā)酵失重曲線Fig.1 Weight loss situation of yeast fermentation

表5 發(fā)酵前后理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 5 Index detection results before and after fermentation

通過(guò)圖1發(fā)現(xiàn)，酵母A起酵最慢，在純蘋果汁條件下，不能很快的適應(yīng)此環(huán)境，發(fā)酵能力最弱；而酵母C起酵最快，整體發(fā)酵能力強(qiáng)于酵母A和B，能夠較好的適應(yīng)純蘋果汁的環(huán)境進(jìn)行增至發(fā)酵。通過(guò)表5發(fā)現(xiàn)，貧氮條件下，在α-氨基氮的利用率以及糖的利用率方面，C的α-氨基氮的利用率為49.52%，而同等情況下A為14.24%，B為15.32%。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選取發(fā)酵菌株為酵母C。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 溫度對(duì)Cider Beer發(fā)酵的影響發(fā)酵時(shí)間為7 d，酵母接種量為1×107個(gè)/mL，發(fā)酵溫度分別是8、11、14、18℃。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵溫度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)Cider Beer的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on cider beer

由圖2可見，一定發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的增加，Cider Beer的感官品評(píng)的分值先增加后減少。在低溫發(fā)酵條件下，發(fā)酵周期較長(zhǎng)，可使得蘋果汁中特有的揮發(fā)性香味物質(zhì)生成，并且使酒體口感更協(xié)調(diào)，但是過(guò)低的發(fā)酵溫度，酵母起酵晚，發(fā)酵速率過(guò)低，而高溫發(fā)酵會(huì)造成揮發(fā)損失，使酒體淡薄[16]。

在發(fā)酵過(guò)程中，隨著溫度的升高，Cider Beer中的含糖量先增加后減少，當(dāng)8℃條件下發(fā)酵，酵母起酵晚而造成發(fā)酵遲滯；綜合以上的因素，選擇發(fā)酵溫度為11℃。

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)Cider Beer的影響調(diào)整發(fā)酵溫度11℃、酵母接種量為1×107個(gè)/mL，發(fā)酵時(shí)間分別是4、6、8 d和10 d。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)其乙醇體積分?jǐn)?shù)、糖度并進(jìn)行感官品評(píng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

發(fā)酵時(shí)間是影響啤酒外觀、口感和風(fēng)味的重要因素，在一定的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，啤酒外觀清亮度會(huì)隨時(shí)間增加而提高，香氣更協(xié)調(diào)，風(fēng)味口感也會(huì)更宜人[17]。由圖3可見，感官品評(píng)得分在0～6 d內(nèi)逐漸提高，在第6天時(shí)達(dá)到最大值，之后6～10 d感官品評(píng)指標(biāo)不斷下降。在發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌會(huì)持續(xù)進(jìn)行代謝將糖分解為酒精，乙醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間逐漸升高。綜上所述，較適發(fā)酵時(shí)間為6 d左右。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)Cider Beer的影響Fig.3 Effect of fermentation time on cider beer

2.3.3 酵母接種量對(duì)Cider Beer的影響酵母接種量是影響啤酒感官品評(píng)的重要因素，它會(huì)影響啤酒的風(fēng)味物質(zhì)形成和乙醇體積分?jǐn)?shù)[18]。本研究在11℃的發(fā)酵溫度下，發(fā)酵時(shí)間6d，酵母接種量分別是6×106個(gè)/mL、8×106個(gè)/mL、10×106個(gè)/mL、12×106個(gè)/mL和16×106個(gè)/mL。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，確定較佳酵母接種量的范圍，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可見，酵母接種量在6×106個(gè)/mL～10×106個(gè)/mL之間時(shí)，感官品評(píng)指標(biāo)隨著酵母接種量的增加而提高。當(dāng)酵母接種量在10×106個(gè)/mL～16×106個(gè)/mL之間時(shí)，感官品評(píng)指標(biāo)隨著酵母接種量的增加而減少。由圖4還可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中，糖度隨著酵母接種量的增加而整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，同時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)整體升高。當(dāng)接種量在10×106個(gè)/mL時(shí)，糖度下降量和乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高量比較?。痪C上所述，選擇較適接種量為10×106個(gè)/mL。

圖4 酵母接種量對(duì)Cider Beer的影響Fig.4 Effect of yeast inoculation quantity on cider beer

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析根據(jù)以上的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和酵母菌的接種量3個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行L9（34）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表 6 所示。

表6 實(shí)驗(yàn)的因素水平表Table 6 Factors and levels of experiment

由表7中各因素k和R的大小，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析；通過(guò)極差R分析判斷，各因素對(duì)感官指標(biāo)影響的主次順序是：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞酵母接種量。并通過(guò)感官指標(biāo)得出較佳條件為A2B3C1，即發(fā)酵溫度為11℃，發(fā)酵時(shí)間為7 d，酵母接種量為8×106個(gè)/mL。

表 7 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 7 L9（34） orthogonal experiment results and analysis

根據(jù)表8進(jìn)行方差分析，其中C的平均方差小于2倍的誤差e的平均方差，為了提高F檢驗(yàn)的靈敏度，我們將C的偏差平方和、自由度并入誤差e的偏差平方和、自由度。通過(guò)F比值與F臨界值的對(duì)比，A與B為主要因素，而C為次要因素，其中A與B對(duì)感官指標(biāo)有非常顯著的影響，并且各因素對(duì)感官指標(biāo)影響的主次順序是：A>B>C，這與極差分析所得結(jié)果一致。

表8 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4.2 最佳工藝條件驗(yàn)證由正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到較佳工藝條件，即發(fā)酵溫度為11℃，發(fā)酵時(shí)間為7 d，酵母接種量為8×106個(gè)/mL，為了驗(yàn)證工藝條件可靠性，采用該發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并將最終產(chǎn)品與市售19種蘋果酒進(jìn)行同時(shí)進(jìn)行感官品評(píng)實(shí)驗(yàn)，并分別檢測(cè)其總糖、總酸、游離氨基酸和多酚質(zhì)量濃度，結(jié)果如表9所示。

表9 驗(yàn)證結(jié)果與市售產(chǎn)品感官品評(píng)和理化指標(biāo)Table 9 Result of sensory evaluation and index detection of the sample and products

對(duì)Cider Beer而言，入口合適的酸味可以讓口腔有“被充滿”的感覺，從而構(gòu)成酒體的框架，讓酒體更飽滿，適宜的甜味讓啤酒更利口，恰當(dāng)范圍的糖酸比是保持酒體協(xié)調(diào)的重要因素。由表9可見，口感品評(píng)得分較高的樣品（感官品評(píng)前9個(gè)）的總糖質(zhì)量濃度在9.5～15 g/L之間，總酸質(zhì)量濃度在7～10 g/L之間，相應(yīng)的樣品更被消費(fèi)者喜愛。本產(chǎn)品總糖質(zhì)量濃度為13.28 g/L，總酸質(zhì)量濃度為6.5 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)為2.85%mass，優(yōu)化后感官品評(píng)得分為83.5，感官品評(píng)得分在20個(gè)樣品中排名第2，產(chǎn)品具有適宜的糖酸比，外觀為金黃色，口味醇正爽口，有明顯的果香味和酒花香氣，為消費(fèi)者較喜歡的產(chǎn)品。本產(chǎn)品發(fā)酵度為46.51%，普遍低于其它樣品，確保以更低的乙醇體積分?jǐn)?shù)和適宜的總糖來(lái)滿足國(guó)內(nèi)消費(fèi)者的口味偏好。

游離氨基酸和多酚是Cider Beer中重要的呈味物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，氨基酸可以呈現(xiàn)甜、酸、澀、鮮、苦等味感[18]，一定量的多酚可以增加酒體的平衡感，使酒更豐滿。由表9可見，本產(chǎn)品游離氨基酸質(zhì)量濃度為3.60 g/L，在20個(gè)樣品中排名第3，多酚質(zhì)量濃度為1.04 g/L，在20個(gè)樣品中排名第8，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)。

3 結(jié)語(yǔ)

Cider Beer是一種以蘋果汁為原料，結(jié)合低溫啤酒釀造工藝研制的發(fā)酵型特種啤酒。本產(chǎn)品最終選取7號(hào)樣品的濃縮蘋果汁為發(fā)酵原料，選取酵母C為發(fā)酵菌株。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)證明，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間作為主要因素，對(duì)最終發(fā)酵產(chǎn)品感官指標(biāo)具有非常顯著的影響，各因素對(duì)感官指標(biāo)影響的主次順序是：發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>酵母接種量。本產(chǎn)品選取較佳工藝條件是發(fā)酵溫度為11℃，發(fā)酵時(shí)間為7 d，酵母接種量為8×106個(gè)/mL，所得產(chǎn)品的總糖質(zhì)量濃度為13.28 g/L，總酸質(zhì)量濃度為6.5 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)為2.85%mass，發(fā)酵度為46.51%，游離氨基酸質(zhì)量濃度為3.60 g/L，多酚質(zhì)量濃度為1.04 g/L；經(jīng)主酵過(guò)濾后所得Cider Beer外觀為金黃色，口味醇正爽口，果香味和酒花香氣明顯，口味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富。