基于2-酮基-D-葡萄糖酸高產(chǎn)的發(fā)酵條件優(yōu)化研究

羅秋玲，劉 佳，張 權(quán)，楊 彬，陳修來，劉立明

（江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

2-酮基-D-葡萄糖酸 （2-Keto-D-gluconic Acid，2-KGA），屬于有機(jī)酸，是大宗生產(chǎn)產(chǎn)品，其主要應(yīng)用于D-異抗壞血酸鈉 （sodium erthorbate，EN）以及 D-抗壞血酸（Erthorbate acid，EA）的合成，D-異抗壞血酸又稱異維生素C，在食品工業(yè)上被廣泛用為食品抗氧化劑[1]。目前，2-KGA的生產(chǎn)方法主要有酶法、化學(xué)合成法和發(fā)酵法，與其他方法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2-KGA原料來源豐富、條件溫和、產(chǎn)品安全性好、視為純天然，從而是最具有競爭力的生產(chǎn)方法。

在自然界中，有許多微生物能發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA，主要包括沙雷氏菌屬、假單胞菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬[2]等。其中，因熒光假單胞菌易培養(yǎng)、發(fā)酵效價高等優(yōu)點而被用作國內(nèi)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的菌株。但發(fā)酵過程中仍存在一些弊端：1）培養(yǎng)基氮源使用昂貴的有機(jī)氮源，蛋白胨、酵母膏等；2）發(fā)酵產(chǎn)物成分復(fù)雜，不利于下游提取等；3）滅菌不徹底易引發(fā)噬菌體污染。雖然可以通過篩選抗噬菌體菌株[3-4]、并采用發(fā)酵優(yōu)化及固定化方式來降低噬菌體感染、提高發(fā)酵效價、降低下游提取難度，但仍避免不了噬菌體感染問題[5-7]。因此，篩選一株以無機(jī)氮為氮源的2-KGA生產(chǎn)菌株對工業(yè)化生產(chǎn)2-KGA以及擴(kuò)大其在食品、化工及醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要作用。

目前，國內(nèi)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA過程中使用無機(jī)氮源的報道較少。本研究以硫酸銨作為唯一氮源的沙雷氏菌屬Serratiasp.FMME043為出發(fā)菌株[8]，通過在30 L發(fā)酵罐上調(diào)控發(fā)酵補(bǔ)料和溶氧策略提高2-酮基-D-葡萄糖酸的產(chǎn)量，結(jié)果表明通過優(yōu)化促進(jìn)了葡萄糖向2-KGA轉(zhuǎn)化、提高了2-KGA的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，進(jìn)而有效地降低了生產(chǎn)成本、分離純化難度以及噬菌體污染的風(fēng)險，為后期放大實驗和工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

菌種為沙雷氏菌Serratiasp.FMME043，由實驗室篩選保藏。

1.2 主要試劑與設(shè)備

2-酮基-D-葡萄糖酸鈣 （Sigma），Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），Bio Flo 115型30 L全自動攪拌式發(fā)酵罐 （瑞士Infors），UVmini-1240分光光度計（日本島津公司）。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂0.2，pH 7.0。121℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基 （g/L）：蛋白胨5，牛肉浸取物3，NaCl 5，pH 7.0，121 ℃滅菌 15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：初始葡萄糖100，初始硫酸銨濃度為 5，KH2PO41，Na2SO40.5，MgSO4·7H2O 0.8，MnCl2·4H2O 0.036，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.036。 葡萄糖和硫酸銨分別單獨115℃滅菌15 min。

1.4 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)：將活化的保藏菌種接至斜面培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。

種子培養(yǎng)：用接種針從斜面上挑取3～4環(huán)菌，接入種子培養(yǎng)基中（50 mL/500 mL），在30℃、200 r/min轉(zhuǎn)速下的搖床中培養(yǎng)12～14 h。

30 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：30 L發(fā)酵罐中初始裝培養(yǎng)基16 L，溫度30℃，接種量13%，自動流加8 mol/L NaOH控制pH值在6.0。初始攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，通氣量24.0 L/min，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，DO由100%逐漸降低，當(dāng)降到40%時，關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)速使DO維持在40%左右。發(fā)酵過程中每隔4 h取一次樣，并測定菌濃OD600、底物葡萄糖和產(chǎn)物2-KGA。

1.5 葡萄糖及2-KGA產(chǎn)物的檢測

取發(fā)酵液12 000 r/min離心5～10 min，收集上清液并稀釋相應(yīng)倍數(shù)，用高效液相色譜 （HPLC）分析。HPLC條件見文獻(xiàn)[8]。

發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA的糖酸轉(zhuǎn)化率計算為

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖補(bǔ)料方式對發(fā)酵的影響

在發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA的過程中，若一次性投入過高濃度的葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)，會生成并積累大量的代謝副產(chǎn)物，并降低單位細(xì)胞轉(zhuǎn)化2-KGA能力；通過補(bǔ)料降低初始發(fā)酵培養(yǎng)基的黏度，可有效促進(jìn)細(xì)胞對環(huán)境氧和營養(yǎng)成分的充分利用，并解除底物的抑制作用。此外，前期的搖瓶實驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期葡萄糖濃度越低，生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度越高[8]。

以前期實驗為基礎(chǔ)，在種子和發(fā)酵條件以及補(bǔ)料液相同的條件下，考察了發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖的初始濃度為100 g/L時，補(bǔ)加葡萄糖次數(shù)、補(bǔ)加時間對發(fā)酵產(chǎn)2-KGA的影響。采用以下3種補(bǔ)料方式進(jìn)行發(fā)酵，補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)果見圖1。

一次定量補(bǔ)料：當(dāng)葡萄糖濃度降為15～25 g/L時，一次性補(bǔ)加含4 005 g葡萄糖補(bǔ)料液。

圖1 不同葡萄糖補(bǔ)料方式對2-KGA發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different glucose feeding modes on the production of 2-KGA

三次定量補(bǔ)料：當(dāng)葡萄糖濃度降為15～25 g/L時，分3次相等的量進(jìn)行補(bǔ)加（1 335 g/次），使發(fā)酵過程中補(bǔ)加總糖質(zhì)量為4 005 g。

五次定量補(bǔ)料：當(dāng)葡萄糖濃度降為15～25 g/L時，分五次相等的量進(jìn)行補(bǔ)加（801 g/次），使發(fā)酵過程中補(bǔ)加總糖質(zhì)量為4 005 g。

通過比較2-KGA的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)分五次相等量的補(bǔ)加葡萄糖策略的效果最好（圖1）。此時，2-KGA的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到245.7 g/L、0.96 g/g和5.12 g/L/h。出現(xiàn)這種情況的原因是通過補(bǔ)料降低了底物濃度、發(fā)酵液黏度，從而降低了底物抑制作用，并促進(jìn)細(xì)胞對環(huán)境氧和營養(yǎng)物質(zhì)的利用，提高了葡萄糖向2-KGA的轉(zhuǎn)化速率提高了2-KGA的生產(chǎn)強(qiáng)度[9]。

2.2 硫酸銨補(bǔ)料方式對發(fā)酵的影響

在微生物發(fā)酵時，氮源是維持菌體自身生長必要的生長因子，其量的維持是保證菌體生長和轉(zhuǎn)化的必要條件[10]，故考慮在發(fā)酵過程中根據(jù)菌體生長速率的變化加入適量的硫酸銨補(bǔ)充一定的氮源，保持菌體的正常生長和轉(zhuǎn)化。

在最優(yōu)葡萄糖補(bǔ)料方式、維持種子和發(fā)酵條件以及補(bǔ)料液相同條件下，在發(fā)酵培養(yǎng)基的初始硫酸銨濃度為5 g/L時，采用以下3種補(bǔ)硫酸銨方式進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。

一次定量補(bǔ)料：在發(fā)酵16 h，一次性補(bǔ)加含240 g硫酸銨補(bǔ)料液。

間歇定量補(bǔ)料：在發(fā)酵16 h補(bǔ)加含64 g硫酸銨補(bǔ)料液，22 h補(bǔ)加含80 g硫酸銨補(bǔ)料液，28 h補(bǔ)加含96 g硫酸銨補(bǔ)料液。

間歇恒速補(bǔ)料：在發(fā)酵16 h，就以1.25 g/L/h的速度流加硫酸銨補(bǔ)料液，直至含240 g硫酸銨補(bǔ)料液全部補(bǔ)完。

從圖2表明，硫酸銨的分次添加可以使發(fā)酵液中硫酸銨質(zhì)量濃度維持在一個穩(wěn)定的水平，既利于菌體的生長又利于葡萄糖向2-KGA的轉(zhuǎn)化。通過比較發(fā)現(xiàn)間歇定量補(bǔ)料方式效果最好，2-KGA的產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到251.3 g/L，1.01 g/g和5.23 g/L/h。選擇間歇定量補(bǔ)硫酸銨方式。

圖2 硫酸銨補(bǔ)料方式對2-KGA發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of（NH4）2SO4feeding modes on the production of 2-KGA

2.3 不同溶氧水平對發(fā)酵的影響

對于好氧發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物來說，溶氧（Dissolved oxygen，DO）值的控制直接關(guān)系著細(xì)胞的生長和代謝產(chǎn)物的形成[11-12]。

在研究了葡萄糖和硫酸銨補(bǔ)料策略之后，考察了在最優(yōu)補(bǔ)料策略下，不同DO濃度對2-KGA合成的影響。

由圖3知，當(dāng)DO值分別為20%、30%和40%時，隨著其值的提升，細(xì)胞生物量逐漸增加，40%時達(dá)最大為8.11 g/L；當(dāng)DO值50%時，細(xì)胞生物量反而減少。再綜合2-KGA的產(chǎn)量、得率和產(chǎn)率指標(biāo)，溶氧為40%時最優(yōu)，其值分別達(dá)到268.5 g/L、1.04 g/g和 6.10 g/L/h。

綜上可知，發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA是需氧型，DO值的控制要適宜，不是越高越好。可能因為，氧的過高容易產(chǎn)生含氧自由基破壞細(xì)胞組分，從而嚴(yán)重影響菌體的生長代謝[13]。

圖3 溶氧水平對2-KGA發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of dissolved oxygen levels on the production of 2-KGA

2.4 30 L發(fā)酵罐上FMME043發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA

在最優(yōu)葡萄糖和硫酸銨補(bǔ)加策略下維持溶氧為40%，菌株FMME043發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA的過程曲線表明，2-KGA發(fā)酵生產(chǎn)屬于部分生長偶聯(lián)型。如圖4所示，1）菌體生物量：0～4 h為菌體的適應(yīng)階段為延滯期，之后菌體快速生長為對數(shù)生長期，32 h菌體生長減慢為穩(wěn)定期，在36 h菌體干重達(dá)到最大值為8.41 g/L。2）底物葡萄糖：前期0～12 h葡萄糖的量下降很少，12 h之后葡萄糖的量迅速降低，28 h耗糖速率減慢，至發(fā)酵結(jié)束糖耗盡。3）產(chǎn)物2-KGA：0～12 h產(chǎn)物生成較少，12 h之后進(jìn)入快速生成產(chǎn)物時期，28 h后產(chǎn)物的生成速度減慢，至發(fā)酵結(jié)束44 h，2-KGA產(chǎn)量為268.5 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為1.04 g/g。與在30 L發(fā)酵罐上優(yōu)化前[2]相比，2-KGA的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了58.4%，11.6%和72.8%。與其他生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸菌株相比，F(xiàn)MME043產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率最高，對今后的擴(kuò)大化生產(chǎn)也具有重要的指導(dǎo)意義（見表1）。

圖4 30 L發(fā)酵罐上Serratia sp.FMME043發(fā)酵產(chǎn)2-KGA的過程曲線Fig.4 Time curves of 2-KGA fermentation by Serratia sp.FMME043 in a 30 L fermentor

表1 高產(chǎn)2-KGA菌株及其產(chǎn)量Table 1 Strains for high 2-KGA production

3 結(jié) 語

1）在30 L發(fā)酵罐上優(yōu)化確定了發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA的最優(yōu)補(bǔ)加策略及溶氧條件：當(dāng)初糖濃度由100 g/L降至15～25 g/L，采用五次定量補(bǔ)料方式，使整個發(fā)酵過程中葡萄糖濃度低于7%；硫酸銨采用間歇定量補(bǔ)料，16 h補(bǔ)加64 g，22 h補(bǔ)加80 g，28 h補(bǔ)加96 g；溶氧控制在40%。

2）在最優(yōu)條件下，菌體生長延滯期為4 h，36 h菌體干重達(dá)到最大值為8.41 g/L，發(fā)酵44 h時，2-KGA產(chǎn)量達(dá)到268.5 g/L，產(chǎn)率達(dá)到1.04 g/g。

3）通過對溶氧、葡萄糖和硫酸銨等發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化控制，提升了發(fā)酵效價，為今后的2-KGA工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。