響應(yīng)面優(yōu)化汽化過氧化氫殺滅PET瓶?jī)?nèi)表面枯草芽孢桿菌工藝

楚莉沙，黃莉莉，汪良峰，崔政偉*，劉 波，楊亞軍

（1.江南大學(xué) 江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2.江蘇新美星包裝機(jī)械有限公司，江蘇 張家港 215618）

聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）是目前食品包裝領(lǐng)域最常用的一種材料，特別是在飲料灌裝方面，大多數(shù)的飲料瓶是PET材質(zhì)。在無菌灌裝系統(tǒng)中，食品與包裝材料通常是分開進(jìn)行滅菌[1]?，F(xiàn)階段用于PET飲料瓶的滅菌方法主要有：物理法、化學(xué)法及兩者結(jié)合3種[2-6]。但是這些方法并不都能高效地殺滅PET瓶表面的微生物。因此，找到一種快速、無殘留的滅菌方式對(duì)PET瓶進(jìn)行滅菌是保證產(chǎn)品質(zhì)量和提高生產(chǎn)效率所必需的。

過氧化氫具有強(qiáng)氧化性，可形成具有強(qiáng)氧化能力的自由羥基以及活性衍生物，自由羥基和活性衍生物通過破壞微生物的外層保護(hù)結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部DNA而起到殺菌的作用[7]。作為一種綠色環(huán)保殺菌劑，過氧化氫也越來越多地受到人們的重視。近年來，隨著汽化過氧化氫技術(shù)的不斷發(fā)展，汽化過氧化氫滅菌法也成了國(guó)外各國(guó)藥典及滅菌技術(shù)規(guī)范所推崇的方法，并被廣泛用于醫(yī)療衛(wèi)生、生物制藥和實(shí)驗(yàn)室研究等多種領(lǐng)域[7-9]。同時(shí)，就使用過氧化氫滅菌而言，人們也在尋找一種高效、潔凈、成本低廉的滅菌工藝，特別是在環(huán)境保護(hù)和食品領(lǐng)域。

現(xiàn)階段，國(guó)外對(duì)于低濃度汽化過氧化氫殺滅枯草芽孢桿菌的研究[2，10]比較多，汽化過氧化氫用于食品包裝方面也有比較成熟的技術(shù)[11-12]，但國(guó)內(nèi)的相關(guān)報(bào)道較少[13-14]。為此，本實(shí)驗(yàn)以PET瓶坯為模型，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，觀察汽化過氧化氫對(duì)PET瓶坯內(nèi)表面上枯草芽孢桿菌的殺菌效果，并利用響應(yīng)面分析法對(duì)制備汽化過氧化氫的操作工況（H2O2溶液流量、滅菌時(shí)間和滅菌溫度）進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（CMCC（B）63501），江南大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；氯化鈉、無水乙醇、30%過氧化氫，均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)）；營(yíng)養(yǎng)肉湯（國(guó)藥集團(tuán)）、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（國(guó)藥集團(tuán)），均購(gòu)于學(xué)校設(shè)備管理處。

1.2 儀器與設(shè)備

汽化過氧化氫發(fā)生器，江蘇新美星包裝機(jī)械股份有限公司；XFS-280M手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SJ-CJ-2FD型雙人單面潔凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；SPX-200生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Lab dance S25小舞靈旋渦混勻器，上海微川精密儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)[15-16]

1）活化：將保存的枯草芽孢桿菌菌種在平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，于36℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2）培養(yǎng)：將活化后的枯草芽孢桿菌挑取兩環(huán)接種到裝有100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯（經(jīng)滅菌）的250 mL錐形瓶中于36℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

3）確定菌液濃度：先取初始菌液10 mL于90 mL無菌蒸餾水中，然后采用梯度稀釋的方法對(duì)培養(yǎng)好的種子液進(jìn)行稀釋，取稀釋度為10-4、10-5、10-63種菌懸液1 mL滴入已標(biāo)記好的培養(yǎng)皿中，倒入冷卻至45～47℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，輕輕搖勻，室溫放置15 min左右，待培養(yǎng)基充分凝固后，將接種好的平板倒置，即皿蓋朝下放置，放于36℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h。

將培養(yǎng)好的9只平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基從培養(yǎng)箱中取出，10-4、10-5、10-63個(gè)濃度之間的倍數(shù)大概呈10倍，分別計(jì)數(shù)每個(gè)濃度梯度平板上的菌落數(shù)，取3個(gè)平板的平均值為該濃度下1 mL菌懸液的菌落數(shù)。根據(jù)公式

1.3.2 染菌瓶坯制備 試驗(yàn)用瓶坯為PET材質(zhì)，內(nèi)徑約為15 mm，深88 mm，外形尺寸如圖1所示。

圖1 試驗(yàn)用PET瓶尺寸Fig.1 Size of PET bottle for testing

將培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌菌液0.2 mL滴加到無菌瓶坯中，用旋渦混勻器混勻使得瓶坯內(nèi)表面均勻的沾有細(xì)菌懸液。

1.3.3 汽化過氧化氫制備流程圖2為制備汽化過氧化氫的流程圖。30%過氧化氫溶液和壓縮空氣（約0.5 MP）同時(shí)單獨(dú)的輸送到加熱器中，兩者在加熱器中混合并加熱生成汽化過氧化氫。過氧化氫溶液流量和壓縮空氣流量分別通過液體流量計(jì)與控制器和氣體流量計(jì)與控制器進(jìn)行控制，加熱器加熱溫度通過PLC控制器進(jìn)行控制，汽化過氧化氫溫度通過電阻式溫度傳感器測(cè)量。

圖2 汽化過氧化氫制備流程Fig.2 Process flow diagram for preparation of hydrogen peroxide vapour

試驗(yàn)用過氧化氫溶液和壓縮空氣混合加熱器圖如圖3所示。

圖3 過氧化氫溶液和壓縮空氣混合加熱器Fig.3 Mixer and heater for hydrogen peroxide and compressed air

1.3.4 殺菌效果測(cè)定試驗(yàn)在無菌通風(fēng)櫥中進(jìn)行。試驗(yàn)前將染菌瓶坯預(yù)熱到50℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定壓縮空氣流量為150 L/min（5 bar），過氧化氫溶液流量、滅菌溫度和滅菌時(shí)間均可調(diào)。將生成的汽化過氧化氫直接通入到染菌瓶坯瓶口，滅菌一定時(shí)間（2、4、7、10 s）后，用50℃熱風(fēng)將殘留在瓶坯內(nèi)壁的過氧化氫吹干，加入1.8 mL無菌蒸餾水到瓶坯中，不斷用混勻器混勻，充分洗脫后，以傾注法對(duì)殘留菌進(jìn)行回收計(jì)數(shù)。同時(shí)設(shè)置陰陽性對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均滅活細(xì)菌的對(duì)數(shù)值。

1.3.5 汽化過氧化氫殺滅PET瓶坯內(nèi)表面枯草芽孢桿菌的單因素試驗(yàn)

1）H2O2溶液流量的確定。汽化過氧化氫的流量對(duì)殺菌起著至關(guān)重要的作用[17-18]。試驗(yàn)固定滅菌時(shí)間為7 s，滅菌溫度分別為120、140、160℃的情況下，設(shè)置汽化過氧化氫發(fā)生器的過氧化氫溶液流量分別為 8、10、13、16 mL/min。 測(cè)定不同過氧化氫溶液流量對(duì)PET瓶?jī)?nèi)表面枯草芽孢桿菌的殺菌效果。

表1 30%H2O2流量單位換算Table 1 Unit conversion of 30% hydrogen peroxide flowrate

2）滅菌溫度的確定。滅菌溫度的選定對(duì)殺菌效果有一定的影響[12]。溫度過低會(huì)導(dǎo)致過氧化氫汽化不完全，導(dǎo)致原料的浪費(fèi)以及對(duì)后處理帶來困難，溫度過高則會(huì)導(dǎo)致過氧化氫分解，達(dá)不到殺菌效果。試驗(yàn)前對(duì)設(shè)備進(jìn)行預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滅菌溫度設(shè)為100℃時(shí)，過氧化氫溶液會(huì)出現(xiàn)汽化不完全的情況，瓶坯內(nèi)壁生成的凝結(jié)霧滴比較大，殺菌效果比較差，可能是因?yàn)榱u基具有親水性，生成的霧滴將羥基分子包裹在中心，大大降低了與細(xì)菌的接觸，使得殺菌效果變?nèi)?。因此，根?jù)預(yù)處理結(jié)果以及國(guó)內(nèi)外的研究[19-21]，考到過氧化氫溶液的沸點(diǎn)和設(shè)備的溫度設(shè)定情況，選擇滅菌溫度為120、140℃和160℃進(jìn)行試驗(yàn)。

固定滅菌時(shí)間為7 s，H2O2溶液流量分別為8、10、13、16 mL/min的情況下，設(shè)置汽化過氧化氫發(fā)生器的滅菌溫度分別為120、140、160℃，測(cè)定不同滅菌溫度對(duì)PET瓶?jī)?nèi)表面枯草芽孢桿菌的殺菌效果。

3）滅菌時(shí)間的確定。滅菌時(shí)間是影響殺菌效率的重要因素，并且會(huì)影響生產(chǎn)效率。試驗(yàn)固定滅菌溫度為140℃，H2O2溶液流量分別為10、13、16 mL/min的情況下，考慮到工業(yè)生產(chǎn)中對(duì)滅菌效率的要求，設(shè)定滅菌時(shí)間分別為 2、4、7、10 s。 測(cè)定不同滅菌時(shí)間對(duì)PET瓶?jī)?nèi)表面枯草芽孢桿菌的殺菌效果。

1.3.6 響應(yīng)面分析法優(yōu)化滅菌工況根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[22]，在單因素的基礎(chǔ)上，以殺菌對(duì)數(shù)值為響應(yīng)值，選取H2O2溶液流量、滅菌溫度和滅菌時(shí)間3個(gè)因素，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 汽化過氧化氫殺菌響應(yīng)面因素水平Table 2 Response surface level of hydrogen peroxide vapour sterilization

試驗(yàn)以3次所得滅菌對(duì)數(shù)值的平均值為響應(yīng)值，共設(shè)有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)，5個(gè)為中心實(shí)驗(yàn)，用以估計(jì)誤差。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析運(yùn)用OriginPro 9軟件對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及響應(yīng)面作圖，采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)，建立回歸模型并對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 H2O2溶液流量對(duì)滅菌效果的影響由圖4可知，在滅菌溫度不變的情況下，隨過氧化氫溶液流量的增加，生成的汽化過氧化氫對(duì)枯草芽孢桿菌的效果逐漸增強(qiáng)。考慮到PET瓶對(duì)殺菌效果的要求，選擇過氧化氫溶液流量在13 mL/min左右比較適宜。

圖4 過氧化氫溶液流量對(duì)殺菌效果的影響Fig.4 Effect of hydrogen peroxide flowlate on sterilization

2.1.2 滅菌溫度對(duì)滅菌效果的影響由圖5可知，在H2O2溶液流量不變的情況下，隨滅菌溫度的升高，滅菌效果逐漸減弱，這可能是因?yàn)殡S溫度的升高，加熱過程中過氧化氫分解逐漸加劇，導(dǎo)致生成的羥基分子變少，因而對(duì)滅菌效果產(chǎn)生了一定的影響。

圖5 滅菌溫度對(duì)殺菌效果的影響Fig.5 Effect of temperature on sterilization

2.1.3 滅菌時(shí)間對(duì)滅菌效果的影響由圖6可知，在H2O2溶液流量不變的情況下，隨滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，殺菌效果逐漸增強(qiáng)。綜合考慮PET瓶對(duì)殺菌效果以及工業(yè)生產(chǎn)對(duì)滅菌效率的要求，選擇滅菌時(shí)間為7 s左右比較適宜。

圖6 滅菌時(shí)間對(duì)殺菌效果的影響Fig.6 Effect of treatment time on sterilization

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化殺菌工藝

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析結(jié)果采用Design Expert8.0軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程為

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及殺菌結(jié)果Table 3 Experimental design and sterilization results for RAS

2.2.2 回歸模型顯著性及響應(yīng)面分析由表4可得，經(jīng)方差分析[23]后，該回歸方程的P值 ＜0.05，表明模型比較顯著，失擬項(xiàng)的P值為0.079 4＞0.05（不顯著），說明模型擬合得很好。相關(guān)系數(shù)R2=1.74/1.80=0.966 7，說明回歸方程與實(shí)際數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合良好，能很好地反映出H2O2溶液流量、滅菌溫度和滅菌時(shí)間對(duì)滅菌效果（殺菌對(duì)數(shù)值）的影響。同時(shí)可得，H2O2溶液流量和滅菌時(shí)間一次項(xiàng)對(duì)殺菌對(duì)數(shù)值的影響非常顯著，滅菌溫度的一次項(xiàng)比較顯著，滅菌時(shí)間的二次項(xiàng)對(duì)殺菌對(duì)數(shù)值的影響比較顯著，而H2O2溶液流量和滅菌溫度的二次項(xiàng)均不顯著，交互項(xiàng)對(duì)殺菌對(duì)數(shù)值的影響均不顯著。所以，試驗(yàn)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素對(duì)滅菌效果的影響大小順序?yàn)椋簻缇鷷r(shí)間＞H2O2溶液流量＞滅菌溫度。

對(duì)回歸模型進(jìn)行分析得出，汽化過氧化氫殺滅枯草芽孢桿菌的最佳工藝條件為：過氧化氫（液態(tài)）流量14.13 mL/min，滅菌時(shí)間9.33 s，滅菌溫度120℃，此條件下殺菌對(duì)數(shù)值預(yù)測(cè)為5.464 07 log。考慮到試驗(yàn)操作時(shí)的方便，將最優(yōu)工藝條件修正為過氧化氫溶液流量14 mL/min，滅菌時(shí)間9 s，滅菌溫度120℃，在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，測(cè)得的殺菌對(duì)數(shù)值的平均值是5.40 log，與理論預(yù)測(cè)值接近，說明此回歸模型預(yù)測(cè)可靠，能夠很好地反映出試驗(yàn)各因素對(duì)滅菌效果（殺菌對(duì)數(shù)值）的影響。

運(yùn)用OriginPro軟件作出各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值交互影響的等高線與響應(yīng)面圖（圖7）。從圖7可以清楚地看出，過氧化氫溶液流量、滅菌時(shí)間和滅菌溫度兩兩之間交互作用的響應(yīng)曲面圖均比較平緩，說明各交互作用對(duì)殺菌效果的影響并不顯著。

表4 回歸分析試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of extraction regression analysis

圖7 試驗(yàn)各因素對(duì)殺菌效果的交互影響響應(yīng)面圖Fig.7 Interaction effect of H2O2flow，sterilizing time and sterilizing temperature on sterilization

3 結(jié) 語

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)曲面法對(duì)汽化過氧化氫殺滅枯草芽孢桿菌的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析。利用Design Expert軟件建立了三元二次回歸模型，方差分析得到，各因素對(duì)滅菌效果的影響大小順序?yàn)椋簻缇鷷r(shí)間>H2O2溶液流量>滅菌溫度。H2O2流量和滅菌時(shí)間一次項(xiàng)X1和X2對(duì)殺菌對(duì)數(shù)值（滅菌效果）的影響非常顯著，滅菌溫度一次項(xiàng)X3比較顯著，滅菌時(shí)間二次項(xiàng)X22對(duì)殺菌對(duì)數(shù)值（滅菌效果）的影響比較顯著，而H2O2流量和滅菌溫度二次項(xiàng)X12和X12均不顯著，交互項(xiàng)對(duì)殺菌效果的影響均不顯著。對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，得到汽化過氧化氫殺滅PET瓶?jī)?nèi)表面枯草芽孢桿菌的最佳工藝條件為：過氧化氫溶液流量14 mL/min，滅菌時(shí)間9 s，滅菌溫度120℃，在此條件下試驗(yàn)得出，汽化過氧化氫對(duì)枯草芽孢桿菌的殺菌對(duì)數(shù)值可達(dá)5.40 log，說明建立的回歸模型可靠，能很好地預(yù)測(cè)出H2O2流量、滅菌時(shí)間和滅菌溫度與滅菌效果（殺菌對(duì)數(shù)值）之間的關(guān)系。