斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)病毒性神經壞死病毒的純化分析及檢測方法建立

葛 輝，吳麗云，周 宸，黃種持，吳建紹，鄭樂云，林 琪，楊求華，吳水清，王藝磊，林克冰*

(1.福建省水產研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.集美大學水產學院，農業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021)

石斑魚(Epinephelussp.)隸屬鱸形目(Perciformes)、魚旨科(Serranidae)，廣泛分布于熱帶和亞熱帶沿岸及島礁海域，是世界上最重要的海洋經濟魚類之一。目前，我國已有記錄的石斑魚共45種，主要分布于東南沿海和南海[1]。石斑魚作為我國重要的海水經濟魚類，其養(yǎng)殖產業(yè)已進入規(guī)?；B(yǎng)殖階段，但是隨著養(yǎng)殖密度不斷增加和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，石斑魚的各種病害暴發(fā)頻率也隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大呈現迅速上升的勢頭，極大地制約了我國石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展[2-5]。其中由病毒感染引起的傳染性疾病在魚類病害中最難預防和治療，國內已報道的能引起養(yǎng)殖石斑魚患病的主要有諾達病毒科(Nodaviridae)和虹彩病毒科(Iridoviridae)[6-9]。

神經壞死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)，屬于諾達病毒科(Nodaviridae)，β諾達病毒屬(Betanodavirus)，病原體為二十面體、無囊膜、直徑25～30 nm的RNA病毒[10-11]。NNV基因組由兩條單鏈正RNAs組成，分別為RNA1和RNA2，其中RNA1的功能為RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)，RNA2則可以轉錄翻譯出病毒的外殼蛋白[12-14]。根據RNA2核酸序列同源性分析，將β型諾達病毒分成紅鰭東方鲀神經壞死病毒(Tiger puffer nervous necrosis virus，TPNNV)、擬鲹神經壞死病毒(Striped jack nervous necrosis virus，SJNNV)、條斑星鰈神經壞死病毒(Barfin flounder nervous necrosis virus，BFNNV)和赤點石斑魚神經壞死病毒(Redspotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)4個基因型[14]。由NNV引起的病毒性神經壞死病，也稱魚類腦炎病毒(Fish encepha litis virus，FEV)、病毒性腦病和視網膜病(Viral encephalopathy and retinopathy，VER)，是一種世界范圍內流行的海水魚類病毒病。至今已有報告的受該病危害的魚類包括海水和淡水魚類、溫水性和冷水性魚類：鰻鱺目(Anguilliformes)、鱸形目(Perciformes)、鰈形目(Pleuronectiformes)、鲀形目(Tetraodontiformes)、鱈形目(Gadiformes)，感染的種類包括5個目，涉及16個科，多達40余種，各種石斑魚均可感染此病[15]。而主要發(fā)生在海水魚類種苗生產階段，魚苗死亡率高達90%以上，給海水魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來嚴重的危害[16]。NNV引起的魚類傳染性疾病危害性廣，致病性強，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失。

本研究從患病斜帶石斑魚中分離得到NNV，并在克隆出NNV核酸序列的基礎上，建立了石斑魚神經壞死病毒RT-PCR靈敏度分析、病毒感染細胞實驗，以期為今后在石斑魚養(yǎng)殖產業(yè)中進行病毒檢測提供技術支持，同時為石斑魚苗種培育生產中神經壞死病毒病的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗魚

發(fā)病斜帶石斑魚采自于小嶝水產科技有限公司水產養(yǎng)殖場的發(fā)病現場，取回實驗室后-80℃保存。

1.1.2 試劑

RNA提取試劑盒和2×Taq Plus PCR MasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司；反轉錄試劑盒購自全式金生物技術有限公司；pUC-19載體購自TaKaRa公司；DL 10 000 DNA標準物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物合成和DNA測序委托英濰捷基(上海)貿易有限公司完成；柱式DNA膠回收試劑盒和柱式質粒DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；核酸染料GV-Ι(Gold ViewTM)為賽百盛基因技術有限公司產品；其余試劑均為國產或進口分析純。

1.2 病毒外殼蛋白克隆、序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

1.2.1 病毒核酸抽提

取發(fā)病的斜帶石斑魚的腦、眼部組織，剪碎后，參照天根RNA提取說明書提取總RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計

根據GenBank數據庫公布的斜帶石斑魚神經壞死病毒的RNA2核苷酸序列，設計1對特異性引物。上游引物F：5′-CCTGCAGGTCGACTCTAGATAATCCATCACCGCTTTGCAAT C-3′；下游引物R：5′-GTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGCCGAG TTGAGAAGCGATC-3′，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。預期擴增片段約為1 433 bp。

1.2.3 RT-PCR

以提取的RNA為模板，利用反轉錄試劑盒進行cDNA的合成。并以此為模板進行PCR擴增，反應條件為：98℃ 2 min預變性；98℃ 10 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠回收目的基因片段。將回收產物與pUC-19載體連接，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。細胞涂布在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)平板上。從平板挑選40個單菌落進行菌落PCR鑒定重組子，產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，交由英濰捷基(上海)貿易有限公司測序，鑒定重組質粒中的插入序列。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將測序所得基因序列在NCBI上的BLAST程序進行相似性比對，挑選一些較高相似性的序列，運用MEGA 4.0軟件的鄰接法(Neighborhood-joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹[17-18]。

1.3 RT-PCR反應的靈敏度

采用質粒DNA提取試劑盒從轉化的E.coliDH5α中提取重組質粒，并計算所抽提的質粒濃度，以8倍的濃度梯度進行稀釋。將不同稀釋度的質粒作為模板，以sCPRi-RT-1 (5′-GCGAATCCGCAACCCC-3′)和tCPRi-RT-1(5′-CGTATCCGTCTGTTCCTGTC-3′)為引物進行PCR反應，同時PCR反應產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其靈敏度。

1.4 病毒的分離純化

1.4.1 病毒粗提液

取-80℃保存的發(fā)病斜帶石斑魚，將魚頭組織充分研磨，加入0.01 mol/L PBS緩沖液(NaCl 137 mmol/L、KCl 2.7 mmol/L、Na2HPO410 mmol/L、KH2PO42 mmol/L，pH 7.4)，勻漿器充分勻漿。勻漿液在-80℃與25℃反復凍融3次，于4℃、5 000 rpm離心15 min，收集上清液。獲得上清液用PBS緩沖液稀釋10倍后，加入雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)，4℃靜置過夜。0.22 μL濾膜過濾，即獲得病毒粗提液。

病毒粗提液中加入氯仿(V∶V=1∶10)，劇烈震蕩后，于4℃、5 000 rpm離心15 min，收集上清液。上清液于冰浴下，邊攪拌邊緩慢加入NaCl和PEG6000(聚乙二醇)，使得終濃度分別為0.5 mol/L和10%，4℃靜置過夜。于4℃ 35 000 rpm離心2.5 h，沉淀病毒，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 電鏡觀察

取NNV病毒原液用生理鹽水懸浮，取1滴滴在銅網上，濾紙干燥，加1滴磷鎢酸進行負染2 min，濾紙吸干，電鏡(7600HC，德國Zeiss公司)觀察。

1.5 不同細胞的敏感性

將長成單層的細胞分散轉移到96孔細胞培養(yǎng)板，在無CO2、27℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(設置正常細胞對照組)，每天觀察細胞病變(Cytopathic effects，CPE)直至對照細胞開始老化為止。將上述病毒原液分別接種長滿單層的E11細胞和大黃魚細胞，兩種細胞均置于27℃培養(yǎng)，逐日觀察細胞病理變化。

1.6 病毒確認

為進一步確認人工感染實驗中細胞病變是由NNV引起，利用細胞進行PCR擴增及克隆測序，與NNV進行比對。

2 結果

2.1 克隆與測序

經篩選和菌落PCR(圖1)篩選出陽性菌株，斜帶石斑魚神經壞死病毒RNA2核苷酸序列的測序結果顯示，測序得到的序列大小為1 433 bp，將序列提交到GenBank獲得登錄號為MF510920。RNA2含有一個編碼病毒的主衣殼蛋白(Major capsid protein，MCP)，編碼全長1 017 bp，編碼的蛋白由338個氨基酸組成。

2.2 序列分析

將所得基因序列與GenBank數據庫的4種基因型14株神經壞死病毒外殼蛋白進行同源性比較(表1)，小嶝島病毒株XMNNV和赤點石斑魚神經壞死病毒(RGNNV)基因型病毒株的相似率達98.95%，其中與斜帶石斑魚神經壞死病毒的同源性最高，只有15個核苷酸的差異；與條斑星鰈神經壞死病毒(BFNNV)基因型病毒株的相似率為82.38%～82.52%；與擬鲹神經壞死病毒(SJNNV)基因型病毒株的相似率為78.09%～78.57%；與紅鰭東方鲀神經壞死病毒(TPNNV)基因型病毒株的相似率為45.45%～79.14%。

選取一些相似性較高的序列，對XMNNV與4種基因型14株神經壞死病毒外殼蛋白基因進行分子進化分析，通過MEGA 4.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示(圖2)，XMNNV處于赤點石斑魚神經壞死病毒(RGNNV)基因型主干分枝上，并且與RGNNV處于同一分枝上，系統(tǒng)發(fā)育關系最為密切，而與BFNNV、SJNNV和TPNNV等3種基因型親緣關系較遠。因此病魚斜帶石斑魚的神經壞死病毒應該屬于RGNNV基因型。

表1 用于分子進化分析的病毒株

續(xù)表1

2.3 RT-PCR檢測方法的建立及靈敏度分析

用建立的RT-PCR法進行檢測，同一次試驗中，對8個不同稀釋度的陽性樣品進行PCR擴增。產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳的檢測結果顯示(圖3)，2.2×106～67copies分子均能出現明顯的檢測帶，擴增產物的量隨著模板的降低而減少。本研究建立的檢測神經壞死病毒的方法靈敏度能夠達到67 copies級核酸，而低于0～67 copies的核酸量看不到明顯的條帶。以上結果表明，本研究所建立的NNV RT-PCR檢測方法，可進行穩(wěn)定、可靠的檢測。

注：1～8分別為2.2×106～0 copies/μL核酸樣品。

Note：1～8 were 2.2×106～0 copies/μL nucleic acid samples，respectively.

2.4 病毒電鏡觀察結果

將病毒超速離心后懸浮，滴銅網染色，干燥后電鏡觀察病毒負染結果(圖4)顯示，病毒直徑大小約為20～25 nm，結構為正二十面體。

2.5 不同細胞的敏感性

接種病毒的E11細胞在27℃培養(yǎng)后有CPE產生，形態(tài)如圖5所示：細胞表現渾圓和空泡化病變，并最終導致細胞分解死亡。接種病毒的大黃魚肌肉細胞在27℃培養(yǎng)后產生CPE，細胞變圓，部分溶解，并慢慢從培養(yǎng)皿壁脫落，最終解體死亡。對E11細胞與大黃魚細胞接種瓶中的細胞做PCR，結果顯示為陽性。

注：1.正常E11細胞對照組；2.感染的E11細胞；3.正常大黃魚細胞對照組；4.感染的大黃魚細胞。

Notes：1.Normal control；2.Infected E11 cells；3.Normal control；4.InfectedLarimichthyscroceacells.

3 討論

近年來，隨著我國海水魚類工業(yè)化養(yǎng)殖的逐步推進，石斑魚養(yǎng)殖產業(yè)的快速發(fā)展，長期肆虐的魚類NNV也呈現出暴發(fā)的潛在趨勢，給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失。病毒病是魚類疾病中最難以治療的一類疾病，主要是以預防為主，因此對魚類NNV的監(jiān)測是控制并消滅魚類NNV的重要前提。已證實魚類NNV的傳播有垂直和水平兩種傳播途徑[19-21]，其中垂直傳播是最主要的傳播途徑，Kuo等[22]研究報道病毒可存在于受精卵的卵膜內，而碘試劑只能消毒作用于受精卵表面，無法徹底切斷病毒的垂直傳播。有關研究對石斑魚育苗組織的病毒分布檢測結果顯示，石斑魚育苗的腦、視網膜、鰓、心臟、肝和腸的血細胞中均會有分布[23]，對石斑魚育苗生產過程NNV傳播途徑中的親魚、卵、餌料等關鍵環(huán)節(jié)開展病毒檢測是防治NNV的關鍵。

迄今，已經建立的很多關于檢測NNV的方法：酶聯反應吸附實驗、熒光抗體實驗、細胞培養(yǎng)、分子生物學等都被用于神經壞死病毒的檢測中。其中，分子生物學檢測方法在水產養(yǎng)殖業(yè)病原診斷中快速發(fā)展，而且隨著方法以及技術的不斷優(yōu)化與更新，其已成為疾病診斷的主要手段。聚合酶鏈式反應技術(PCR)問世以來，憑其靈敏性、特異性和快速性而被廣泛應用于分子生物學等領域。Nishizawa等[24]首次建立了魚類諾達病毒的PCR檢測法，擴增出外殼蛋白的部分基因序列，隨后學者們相繼開展了該病毒外殼蛋白的研究。熒光定量RT-PCR[25]和反轉錄環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP)[26]都有報道能夠準確地檢測魚類NNV，但仍然存在一些局限性。熒光定量RT-PCR檢測的靈敏度高，但需要的儀器復雜，對操作人員水平要求也較高，不能滿足現場應用；LAMP檢測使用染料法對擴增產物進行顯色，容易出現假陽性的情況，特異性較差。魚類病毒性神經壞死病危害性廣、復雜度高、發(fā)病快，因此針對其建立一種操作簡便、檢測周期短且特異性強的現場快速檢測方法，為我國水產養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供保障是非常有必要的。

本研究根據GenBank數據庫公布的斜帶石斑魚神經壞死病毒的RNA2核苷酸序列，設計了1對引物，擴增出編碼全長為1 017 bp病毒的主衣殼蛋白，編碼的蛋白由338個氨基酸組成。依據NNV外殼蛋白核酸序列，NNV分為4種基因型[14]，將XMNNV與4種基因型中的14株病毒株進行同源性比對和分子進化分析，結果顯示，XMNNV與RGNNV外殼蛋白核酸序列相似率最高，達到98.95%，并且在分子系統(tǒng)進化樹中與RGNNV的親緣關系較其他3種基因型的病毒更近。通過序列的多重比對與分析，證明小嶝島分離株XMNNV與其它的RGNNV存在一定的基因序列差異，這可能是因為魚類神經壞死病毒在傳播的過程中，其RNA基因組不穩(wěn)定，容易產生變異現象[27]。本研究建立了RT-PCR技術，用于臨床NNV診斷，同時，根據NNV衣殼蛋白的核酸序列設計引物，通過試驗檢測，對8個稀釋度的樣品進行定量RT-PCR擴增，最小可檢出67個病毒拷貝數，表明其具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和可重復性。

進一步研究探討病毒本質并對病毒性疾病進行診斷，制備獲得純凈的病毒，對病毒顆粒的物理化學性質和病毒遺傳物質結構的深入研究至關重要，其中，超速離心法提純病毒是一種很有效的手段，在國內外也已有大量的研究。Chi等[23]采用了超速離心法對來源于斜帶石斑魚魚鰭細胞GF-1培養(yǎng)的石斑魚神經壞死病毒(GNNV)進行了純化；黃劍南等[28]也采用了超速離心法對赤點石斑魚諾達病毒RG-CN進行了純化。本研究采用超速離心法從患病斜帶石斑魚中分離得到NNV，觀察病毒的形態(tài)特征，結果顯示，病毒直徑大小約為20～25 nm，結構為正二十面體。在E11細胞系及大黃魚細胞的感染實驗中表現出了較強的致病性。有研究者證明，不同地理株型的魚類神經壞死病毒對于不同的魚種致病力有差異[29]，而小嶝島分離株XMNNV的感染結果證明其具有較強的致病力。

本研究中，從患病斜帶石斑魚中分離得到NNV，并在克隆出NNV核酸序列的基礎上，建立了石斑魚神經壞死病毒RT-PCR靈敏度分析，該方法具有操作簡單、特異性強、檢測周期短、穩(wěn)定性好等優(yōu)點；并進行了病毒感染細胞實驗，以期為今后在石斑魚養(yǎng)殖產業(yè)中進行病毒檢測提供技術支持，同時為石斑魚苗種培育生產中神經壞死病毒病的防治奠定基礎。