檜木精油對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性咽炎動(dòng)物模型的作用機(jī)制研究

蔣兆梅，楊應(yīng)亮，胡必鳳，譚志冠，麥國鳳，阮 萍

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

慢性咽炎為咽部黏膜、黏膜下層及淋巴組織的彌漫性慢性炎癥，常為上呼吸道慢性炎癥的一部分。隨著生活環(huán)境的改變，慢性咽炎的患病率急劇增高［1］。治療慢性咽炎的方法很多，但傳統(tǒng)中藥見效慢，西醫(yī)主要采用抗菌藥物治療，可能造成咽部正常菌群失調(diào)，效果不太理想。植物精油是由植物的根、莖、葉、花或果實(shí)通過擠壓、蒸餾、萃取、析出等方式提煉出的一類重要次生物質(zhì)，也稱芳香油、揮發(fā)油，通常由數(shù)十種甚至數(shù)百種分子量小的簡單化合物組成，其成分復(fù)雜多樣［2－3］。研究表明，植物精油具有抑菌、抗氧化、殺蟲等生物活性，如薄荷、尤加利、云杉及乳香精油等在多種疾病中都有一定的治療作用［4－7］。Rantzsch等［8］發(fā)現(xiàn)，尤加利精油對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者體內(nèi)提取的肺泡巨噬細(xì)胞具有一定的抗炎作用。本研究使用的檜木精油是從紅檜與扁柏中提取的，其主要成分是萜類化合物，具有抗炎癥、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等作用［9－10］。本文旨在探索檜木精油在治療慢性咽炎中的療效及其可能存在的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～220 g，雄性，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（湘）2016－0002。

1.2 藥物與試劑 檜木精油（廣西檜元素生物科技有限公司，批號(hào)：161101）；慢嚴(yán)舒檸清喉利咽顆粒（山西桂龍醫(yī)藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20053117）；氨水（上海化學(xué)試劑有限公司，許可證編號(hào)：XK 13－2010279012Ⅱ；規(guī)格：每瓶500 ml；濃度：25%～28%）；白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子（TNF－α）試劑盒為上海藍(lán)基生物產(chǎn)品，批號(hào)分別為20151008、20150903。

1.3 儀器 喉頭噴霧器（江蘇平安醫(yī)療器械有限公司）；ST－360酶標(biāo)儀（上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）；T6紫外可見分光光度計(jì)（北京普利生有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有效公司產(chǎn)品）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組［11］將48只SD雄性大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、檜木精油低劑量組（簡稱“檜低組”）、檜木精油中劑量組（簡稱“檜中組”）、檜木精油高劑量組（簡稱“檜高組”）、慢嚴(yán)舒檸清喉利咽顆粒組（簡稱“慢舒組”），共6組，每組8只。以苦味酸標(biāo)記，并記錄每只大鼠的重量，各組大鼠均用普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。模型組、檜低組、檜中組、檜高組、慢舒組動(dòng)物第1～15天上、下午各用2.5%氨水噴其咽部1次，每次用喉頭噴霧器噴3撳；空白組第1～15天同法予蒸餾水噴咽部。每日觀察大鼠的納食、活動(dòng)量、飲水量、口腔分泌物及有無搔抓口咽部動(dòng)作等，并每日觀察大鼠咽部1次。模型組于第16天腹主動(dòng)脈取血5 ml，隨后處死，自大鼠環(huán)狀軟骨水平切斷氣管食管，取下咽部黏膜及其下組織以供作病理切片觀察。造模完成后，第16～25天參照李儀奎《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中的人與動(dòng)物劑量換算方法［12］，慢舒組每天按9 g/kg劑量給藥，用時(shí)以55℃蒸餾水配置成濃度為0.1 g/ml的溶液進(jìn)行噴咽；檜低組、檜中組、檜高組每天劑量按0.25 g/kg、0.5 g/kg、1 g/kg給藥，用時(shí)以 55℃蒸餾水配置成與慢舒組體積相等的溶液進(jìn)行噴咽；空白組予同體積蒸餾水。

2.2 IL－1β及TNF－α含量測定 采用ELISA法檢測IL－1β、TNF－α。樣品處理：大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血5 ml左右置于抗凝采血管中，靜置15 min后置離心機(jī)中2 000 r/min，取血清于－20℃保存?zhèn)溆?。?biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，按順序編號(hào)，每連續(xù)2孔為一組，所加試劑、操作相同，稀釋、棄液后各孔加樣量都為50μl，TNF－α標(biāo)準(zhǔn)孔濃度分別為 240 ng/L，160 ng/L，80 ng/L，40 ng/L，20 ng/L；IL－1β 標(biāo)準(zhǔn)孔濃度分別為30 ng/L，20 ng/L，10 ng/L，5 ng/L，2.5 ng/L。加樣：待測樣品稀釋5倍反應(yīng)（待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40 μl，然后再加待測樣品 10 μl），封板混勻，37 ℃溫育30 min，濃縮洗滌液稀釋后重復(fù)洗滌5次，拍干。加酶：除空白孔，每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，溫育、洗滌同前。顯色：每孔先后加顯色劑A、B各50μl，搖勻，37℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)。測定：以空白孔調(diào)零，在15 min內(nèi)于450 nm波長處依序測量各孔的吸光度（OD值），依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度方程算出樣品中 IL－1β、TNF－α 的濃度。

2.3 病理形態(tài)學(xué)觀察 腹主動(dòng)脈采血后，處死大鼠，暴露大鼠咽部并觀察，取大鼠咽部組織，于4%甲醛溶液中固定，以100%、95%、85%、75%、60%梯度乙醇逐步脫水，二甲苯透明組織，石蠟包埋，切片約4μm，HE染色，中性樹脂封片，并于光鏡下觀察各組大鼠咽組織病理變化，并進(jìn)行分級(jí)評(píng)分［13］。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)共分5級(jí)：0分（－），正常結(jié)構(gòu)，黏膜、固有膜層無水腫，無炎癥細(xì)胞浸潤；1分（＋），黏膜上皮增生不明顯，固有層水腫，上皮下層輕度炎癥細(xì)胞浸潤；2分（＋＋），黏膜上皮輕度增生，上皮下層有炎癥細(xì)胞浸潤；3分（＋＋＋），黏膜上皮中度增生，上皮腳釘突形成并下延；4分（＋＋＋＋），黏膜上皮重度增生，腺上皮壞死，上皮下層有炎癥細(xì)胞浸潤。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差分析；病理形態(tài)學(xué)觀察的組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

本次研究共納入48只大鼠，造模15天后取模型組2只，用于病理切片觀察大鼠咽部組織是否有慢性炎癥改變，中途不明原因死亡6只。最后每組動(dòng)物納入統(tǒng)計(jì)的數(shù)量：空白組8只、模型組6只、檜高組6只、檜中組7只、檜低組8只、慢舒組7只。

3.1 檜木精油對(duì)大鼠一般狀態(tài)的影響

3.1.1 納食方面 造模后至給藥前，造模組及給藥組納食均有減少，空白組無明顯變化。給藥后，給藥組納食有所增加。

3.1.2 活動(dòng)情況 造模期間空白組活動(dòng)量前后無明顯變化；造模的組別在造模前2天噴氨水后，活動(dòng)量增多，稍亢奮。給藥期間，各組與造模期相比，除未出現(xiàn)亢奮外，活動(dòng)量前后無明顯改變。

3.1.3 飲水頻率及24h飲水總量 空白組飲水頻率及飲水量前后無明顯改變，造模的組別噴氨水3天后飲水頻率及飲水總量均明顯增加，給藥后，各組飲水量持續(xù)增加。

3.1.4 口腔分泌物 造模期間，造模組口腔、鼻腔分泌物增多，并時(shí)常搔抓口部。給藥期間，各組口鼻分泌物有所減少。

3.1.5 咽部情況 造模3天后模型組咽部充血腫脹明顯、色澤鮮紅；15天后，咽部呈暗紅色，光澤欠佳，經(jīng)生理鹽水、檜木精油、慢嚴(yán)舒檸清喉利咽顆粒干預(yù)治療10d后，空白組咽部黏膜濕潤有光澤；模型組見咽部黏膜慢性充血，毛細(xì)血管擴(kuò)張，分泌物增多，有些可見黏膜萎縮，干燥少津；慢舒組咽部紅腫減輕，分泌物較之前減少；檜低組和檜中組咽部仍有充血，但不如給藥前嚴(yán)重；檜高組咽部僅輕度紅腫，黏液少見。

3.2 檜木精油對(duì)慢性咽炎大鼠咽部組織病理形態(tài)學(xué)的影響 見圖1～圖6、表1。

正常組：咽部組織結(jié)構(gòu)清晰，復(fù)層鱗狀上皮光滑平整，固有層及黏膜下層未見水腫，僅可見散在淋巴細(xì)胞浸潤，腺泡小葉結(jié)構(gòu)完整（圖1）。

模型組：大鼠咽部組織分界不清，黏膜上皮角化過度、脫落，固有層和黏膜下層水腫，小血管增生并擴(kuò)張充血，大量炎性細(xì)胞浸潤，腺小葉結(jié)構(gòu)局灶破壞，腺上皮壞死（圖2）。

慢舒組及檜低組：黏膜上皮欠光滑，上皮增生，黏膜下層有炎細(xì)胞浸潤（圖3、4）。

檜中組及檜高組：黏膜上皮角化過度，炎性滲出物較多，上皮增生，上皮腳下延并形成釘突，黏膜下腺體導(dǎo)管擴(kuò)張，有黏液潴留，炎細(xì)胞聚集在黏膜及黏膜下層（圖 5、6）。

圖1 ～圖6 各組大鼠咽部組織形態(tài)圖 （×400）

表1 檜木精油對(duì)慢性咽炎大鼠咽部組織病理形態(tài)學(xué)的影響 （只）

表1顯示，與空白組比較，模型組動(dòng)物咽部組織病理學(xué)分級(jí)加重（P＜0.05）；與模型組相比，檜木精油各劑量組及慢舒組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物咽部組織病理形態(tài)學(xué)分級(jí)均明顯減輕（P＜0.05）。

3.3 檜木精油對(duì)慢性咽炎大鼠血清中IL－1β、TNF－α的影響 見表2。

表2 檜木精油對(duì)慢性咽炎大鼠TNF－α、IL－1β的影響 （x±s）

表2顯示，與空白組比較，模型組TNF－α、IL－1β 水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，慢舒組TNF－α、IL－1β水平明顯降低，檜木精油各劑量組對(duì) IL－1β 水平的降低有明顯作用（P＜0.05），檜木精油各劑量組能在一定程度上減少血清TNF－α的分泌，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

4 討論

慢性咽炎為咽部黏膜、黏膜下層組織的彌漫性慢性炎癥，常為上呼吸道慢性炎癥的一部分。主要由不良習(xí)慣、職業(yè)因素、生活環(huán)境、身體因素、遺傳因素和炎癥引發(fā)［14］。慢性咽炎作為耳鼻咽喉科的常見病，其發(fā)病占咽喉部疾病的10%～12%，多發(fā)生于成年人，城市發(fā)病率高，尤以教師、歌手居多［15］。且治療后極易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響人們的正常生活。患者咽部常有異物感、癢感、灼熱感、干燥感或微痛感，常因周圍炎癥的刺激，咽壁黏膜充血肥厚，呈暗紅色，在咽后壁可見分散突起的小顆?；虺善绱闋?，其周圍有擴(kuò)張的血管網(wǎng)，表面有時(shí)附有黏液或膿性分泌物。萎縮性咽炎與干燥性咽炎黏膜干燥，萎縮變薄，色蒼白發(fā)亮，常附有粘稠分泌物或帶臭味的黃褐色痂皮。

本研究采用低濃度氨水直接噴霧法長時(shí)間刺激大鼠咽部黏膜，建立慢性咽炎大鼠模型，模型動(dòng)物病理損傷和血清細(xì)胞因子指標(biāo)變化與臨床指標(biāo)有一定的相似性，且操作方法簡單安全，是目前使用最廣泛的模型建立方法［11］。實(shí)驗(yàn)表明，在造模2天后，造模動(dòng)物出現(xiàn)口鼻分泌物增多，搔抓口部，咽部組織充血腫脹等體征，造模結(jié)束后組織切片結(jié)果顯示為咽部慢性炎癥病理改變，提示造模成功。

采用低濃度氨水反復(fù)刺激大鼠咽部，形成局部組織急性炎癥，血管通透性增高，釋放多種炎癥介質(zhì)，加重和激活新的炎癥反應(yīng)，造成局部組織變質(zhì)、滲出和壞死，病情容易遷延為慢性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：空白組咽部組織結(jié)構(gòu)清晰，復(fù)層鱗狀上皮光滑平整，固有層及黏膜下層未見水腫，僅可見散在淋巴細(xì)胞浸潤，腺泡小葉結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠咽部組織分界不清，黏膜上皮角化、脫落，固有層和黏膜下層水腫，小血管增生并擴(kuò)張充血，大量炎性細(xì)胞浸潤，腺小葉結(jié)構(gòu)局灶破壞，腺上皮壞死，符合慢性炎癥改變。經(jīng)慢嚴(yán)舒檸清喉利咽顆粒和檜木精油干預(yù)后，局部炎癥均有一定程度改善，與模型組比較，動(dòng)物咽部組織病理學(xué)分級(jí)顯著減輕，說明檜木精油對(duì)損傷的咽部黏膜組織具有修復(fù)作用。

在炎癥反應(yīng)過程中，細(xì)胞因子既是免疫系統(tǒng)的信息傳遞介質(zhì)，又是神經(jīng)、內(nèi)分泌及其他系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互聯(lián)系的重要橋梁［16］。TNF－α是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，由單核－巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生，可增高血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化，并誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子及TNF－α自身的合成與釋放，共同促進(jìn)炎癥反應(yīng)［17］。IL－1β是淋巴細(xì)胞刺激因子，主要由活化的單核－巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，局部低濃度時(shí)主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，局部高濃度時(shí)產(chǎn)生內(nèi)分泌效應(yīng)。炎癥發(fā)生時(shí)，IL－1β主要介導(dǎo)趨化作用，參與白細(xì)胞的滲出和激活，加重炎癥反應(yīng)［18］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組的TNF－α及IL－1β均明顯升高，提示這兩種炎癥介質(zhì)參與了慢性咽炎的發(fā)病進(jìn)程。檜木精油各劑量組及慢舒組血清可能通過降低這兩種炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)，抑制炎癥進(jìn)程。

綜上所述，檜木精油治療慢性咽炎的可能機(jī)制為：減少組織的變性和壞死，降低血管的通透性、減少炎癥細(xì)胞的組織浸潤，促進(jìn)組織修復(fù)；降低血清TNF－α、IL－β等炎癥介質(zhì)水平，促進(jìn)炎癥消除。本研究為檜木精油的抗炎作用提供了新思路，也為將來檜木精油在臨床應(yīng)用方面提供了理論基礎(chǔ)。往后我們將進(jìn)一步探討檜木精油對(duì)炎癥介質(zhì)的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供可靠的證據(jù)。