谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶處理對鴨血豆腐品質(zhì)的影響

王 斌 陳希玲

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

鴨血豆腐是以新鮮鴨血為原料，加入水、食鹽等配料，經(jīng)過促凝、蒸煮殺菌、冷卻成型等工藝流程制成的一種凝膠態(tài)食品。傳統(tǒng)鴨血豆腐的生產(chǎn)主要依靠小作坊手工制作，所得產(chǎn)品均一程度不高，衛(wèi)生安全也得不到保障[2]。目前，市售的鴨血豆腐以冷藏方式為主，仍存在貨架期短、起孔、色澤暗等問題。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase，TG)是一種通過催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)加速蛋白質(zhì)共價交聯(lián)的酶，具有來源廣泛、反應(yīng)條件溫和、對營養(yǎng)成分破壞小等特點。TG能夠催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基與賴氨酸之間的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，形成空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。通過改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與特性賦予產(chǎn)品更好的質(zhì)構(gòu)特性，提高食品的凝膠性與可塑性。Li等[3]研究了TG對豬肉和魚糜混合物質(zhì)量和凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)0.4% TG不僅可以改善相同肉蛋白之間的交聯(lián)，還能增強豬肉和鰱魚蛋白質(zhì)之間的協(xié)同作用，為提高肉制品質(zhì)量提供思路。

本試驗擬研究谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)條件對鴨血豆腐品質(zhì)的影響，并通過單因素和正交試驗優(yōu)化確定最佳的酶處理方式，為運用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改善鴨血豆腐的加工品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮鴨血：無錫市錫南路農(nóng)貿(mào)菜場；

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶：最適溫度40～45 ℃，pH 6.0～7.0，泰興市東圣食品科技有限公司；

氯化鈉、檸檬酸鈉、氯化鈣、戊二醛、磷酸鹽、無水乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

恒溫水浴鍋：DK-8AXX型，上海森信實驗儀器有限公司；

物性分析儀：TA.XT2i型，英國Stab.Micro Systems公司；

高精度分光測色儀：UltraScan Pro1166型，美國Hunterlab公司；

高速落地離心機：Sorvall LYNX6000型，德國Thermo公司；

低場核磁共振分析儀：MesoMR23-060V-I型，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；

真空干燥箱：DZF-6020型，上海森信實驗儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡：su1510型，日本日立株式會社。

1.2 方法

1.2.1 鴨血豆腐工藝流程

鴨血抗凝→加入鹽溶液，調(diào)節(jié)pH至中性→添加TG→抽氣→40 ℃保溫→促凝→蒸煮→冷卻→貯藏[4]15

1.2.2 操作要點

(1) 鴨血抗凝：選取檸檬酸鈉為抗凝劑，每50 mL鮮鴨血中加入1%抗凝劑50 mL后攪拌均勻。

(2) 抽氣：將全血置于真空干燥箱中，40 ℃、真空度0.08 MPa抽10 min。

(3) 促凝：選取氯化鈣為凝固劑，每15 mL鴨血與抗凝劑的混合液中加入1%的凝固劑1 mL。

(4) 保溫：谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的最適溫度范圍是40～45 ℃。王芳等[5]將谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶于40 ℃條件下保溫，探究加酶量等因素對豬血漿蛋白凝膠特性的影響，故本研究選定酶作用溫度為40 ℃。

(5) 蒸煮、冷卻：90 ℃水浴加熱30 min后立刻放入冰水混合物中冷卻至室溫，然后置于4 ℃下保存過夜。

1.2.3 單因素試驗

(1) 酶添加量對鴨血豆腐品質(zhì)的影響：取40 mL鴨血混合液6份，在保溫時間40 min的條件下，按質(zhì)量比分別添加0.00%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%的TG，進行質(zhì)構(gòu)、色差、持水力、蒸煮損失的測定，比較酶添加量對鴨血豆腐品質(zhì)的影響。

(2) 保溫時間對鴨血豆腐品質(zhì)的影響：取40 mL鴨血混合液6份，添加0.20% TG，分別在40 ℃下保溫0，20，40，60 min，進行質(zhì)構(gòu)、色差、持水力、蒸煮損失的測定，比較保溫時間對鴨血豆腐品質(zhì)的影響。

1.2.4 酶處理條件優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進一步采用正交試驗方案進行優(yōu)化。以蒸煮損失率為指標，確定酶量和保溫時間的最優(yōu)參數(shù)組合。

1.2.5 持水力測定 稱取1.000 0 g鴨血豆腐置于2 mL離心管中，于4 ℃、10 000×g離心15 min，取出后先用移液槍吸去上層水分，再用濾紙擦拭表面水分，記錄離心管的總質(zhì)量。按式(1)計算持水力：

(1)

式中：

WHC——持水力，%；

W——空離心管的重量，g；

W1——為離心前離心管+鴨血豆腐的重量，g；

W2——去除離心水分后離心管+鴨血豆腐的重量，g。

1.2.6 蒸煮損失測定 根據(jù)文獻[6]，修改如下：稱取蒸煮前鴨血豆腐的質(zhì)量記為m1，于自封袋中封口，沸水蒸煮5 min后撈出冷卻，蒸煮后鴨血豆腐的質(zhì)量記為m2，按式(2)計算蒸煮損失率。

(2)

式中：

ω——蒸煮損失率，%；

m1——蒸煮前的質(zhì)量，g；

m2——蒸煮后的質(zhì)量，g。

1.2.7 全質(zhì)構(gòu)(TPA)測定 將Φ15 mm×8 mm的圓柱體樣品放于物性儀載物臺，采用TPA模式對樣品進行二次壓縮。參數(shù)設(shè)定：探頭型號P/35，測前速率2.0 mm/s，測中速度1.0 mm/s，返回速率5.0 mm/s，兩次下壓之間間隔5 s，壓縮比50%，觸發(fā)力Auto-5 g，每組樣品重復(fù)測定5次。

1.2.8 紅度測定 根據(jù)文獻[7]，采用標準測色儀測定魚糜凝膠的亮度L*、紅度a*、黃度b*值。

1.2.9 橫向弛豫時間(T2)測定及弛豫數(shù)據(jù)反演 選用CPMG序列測定鴨血豆腐凝膠的橫向弛豫時間T2。切取1～2 g塊狀樣品，處理后放入核磁共振儀中25 mm的直徑核磁管并進行分析。測試參數(shù)設(shè)置：質(zhì)子共振頻率為21 MHz，30 ℃下測量。

1.2.10 微觀結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)文獻[8]，修改如下：將鴨血豆腐樣品切成規(guī)格為4 mm×4 mm×4 mm的立方體，在pH 7.2、體積分數(shù)2.5%的戊二醛中進行前固定，再用pH 7.2、0.1 mol/L的磷酸緩沖液洗滌3次，每次間隔30 min；然后分別用30%，50%，70%，80%，90%的乙醇進行梯度脫水3次，每次15 min；接著用無水乙醇脫水3次，每次持續(xù)15 min。將處理后的樣品置于-20 ℃預(yù)冷的真空冷凍干燥機中干燥27～28 h，噴金處理后用掃描電子顯微鏡進行凍干鴨血豆腐的微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理與分析 通過軟件SPSS 19.0的單因素方差分析和LSD后特設(shè)測試(最小顯著差異)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Excel、Origin進行圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗條件優(yōu)化

2.1.1 TG添加量對鴨血豆腐品質(zhì)的影響

(1) 持水力和蒸煮損失：持水性是反映蛋白凝膠穩(wěn)定性的重要參數(shù)[9]。蒸煮損失主要損失的是水，因此持水性較高的樣品蒸煮損失率相應(yīng)較低。由表1可知，0.10%～0.15% TG時，持水性下降，0.20%～0.30% TG時持水性改善最佳。這是因為TG促進蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)形成牢固的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，截留了大量的水，從而提高了鴨血豆腐持水性。但繼續(xù)添加TG，持水性變化不大，可能是蛋白質(zhì)濃度是固定的，TG濃度增加的同時底物濃度并未隨之增加，因此無法促進更多的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，截留的水分含量也就變化極微。

(2) 全質(zhì)構(gòu)：不同添加量的TG能夠影響鴨血豆腐的質(zhì)構(gòu)特性，其對硬度、彈性、內(nèi)聚性、回復(fù)性的影響不顯著；但膠著性卻隨著酶添加量的增加而顯著增加(表2，P<0.05)，在添加量0.25%時達到最高值691.99，較空白組增加了57.40%。膠著性是模擬樣品破裂成吞咽狀態(tài)時所需要的能量，它反映的是分子間結(jié)合作用的強弱或者樣品在抵抗外界損壞時保留自身完整性的能力，該數(shù)值的上升說明TG的存在促進了血漿蛋白之間的交聯(lián)，賦予鴨血豆腐更好的韌性。因此添加0.25% TG的鴨血豆腐在運輸過程中更能經(jīng)受外界的損壞。

表1 TG添加量對鴨血豆腐持水力和蒸煮損失的影響?

Table 1 Effects of TG dosage on WHC and stewing loss of duck blood tofu %

? *表示與空白組比較，P<0.05。

表2 TG添加量對鴨血豆腐全質(zhì)構(gòu)的影響?

? *表示與空白組比較，P<0.05。

(3) 色度：L*和a*對人的感官影響更為密切，應(yīng)當作為評價鴨血豆腐品質(zhì)的主要參考指標[4]36。由表3可知，添加TG后紅度顯著增加，添加量在0.15%以后紅度值趨于穩(wěn)定，因此添加TG能夠有效改善鴨血豆腐顏色暗沉的情況。

硬度與樣品的保水性等相關(guān)，內(nèi)聚性反映鴨血豆腐的完整性、韌性，是質(zhì)構(gòu)測定時的重要參數(shù)。TG添加量0.25%時，鴨血豆腐質(zhì)構(gòu)特性最好，色澤暗沉的問題也得以改善，該水平下的鴨血豆腐持水力優(yōu)于空白，因此選擇0.25%作為最佳酶處理量。

表3 TG添加量對鴨血豆腐色度的影響?

? *表示與空白組比較，P<0.05。

2.1.2 保溫時間對鴨血豆腐品質(zhì)的影響

(1) 持水力和蒸煮損失：由表4可知，持水性和蒸煮損失率的變化趨勢基本保持一致，二者在40 min 前呈上升趨勢，繼續(xù)保溫至60 min時反而有所下降，但差異性不顯著(P>0.05)。說明保溫時間對鴨血豆腐持水力和蒸煮損失率的影響不大。

表4 TG保溫時間對鴨血豆腐持水力和蒸煮損失的影響

(2) 全質(zhì)構(gòu)：由表5可知，與空白組相比，不同保溫時間下的鴨血豆腐在彈性、膠著性、內(nèi)聚性、回復(fù)性4個指標上并無顯著差異(P>0.05)，說明在添加相同量谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的情況下，保溫時間的改變對鴨血豆腐彈性、膠著性、內(nèi)聚性、回復(fù)性的影響不大。但硬度隨保溫時間延長而增大，40 min時達到最大值(869.70)，40 min 以后又出現(xiàn)回落，可能是保溫時間過長導(dǎo)致已經(jīng)完成交聯(lián)的蛋白質(zhì)凝膠劣化，因此硬度有所下降。

(3) 色度：由表6可知，試驗組鴨血豆腐的紅度均顯著高于空白組(P<0.05)。添加0.20% TG于40 ℃保溫條件下，紅度a*在40 min左右達到最大值(10.22)，此時色澤是最好的。

表5 保溫時間對鴨血豆腐全質(zhì)構(gòu)的影響?

? *表示與空白組比較，P<0.05。

表6 保溫時間對鴨血豆腐色度的影響?

? *表示與空白組比較，P<0.05。

根據(jù)硬度和色度的相關(guān)指標，保溫40 min的鴨血豆腐產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)于其他試驗組，因此保溫時間選擇40 min為宜。

2.2 酶處理條件的正交優(yōu)化

2.2.1 正交優(yōu)化試驗 為進一步優(yōu)化加酶處理鴨血豆腐的生產(chǎn)工藝，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇加酶量、保溫時間做兩因素三水平正交試驗(表7)。分析正交處理鴨血后所得產(chǎn)品的蒸煮損失率，從而進一步確定最佳酶處理方式。試驗設(shè)計及結(jié)果見表8。由表8可知，因素影響的主次關(guān)系為加酶量>保溫時間，最優(yōu)組合為A2B1，即添加0.25% TG，40 ℃下保溫30 min。

2.2.2 最佳組合的驗證實驗

(1) 弛豫時間與水分分布：低場核磁測試作為一種新型的無損檢測方法可以監(jiān)測食品中的水分狀態(tài)和移動情況，為提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性提供了有力的保證[10]。由表9可知，不同處理方式的鴨血豆腐凝膠在1～10 000 ms內(nèi)T2分布出現(xiàn)了4個峰，這4個峰代表了4個組分，T21(<1 ms)、T22(<10 ms)是最難遷移的水，即與大分子緊密結(jié)合的水，根據(jù)蛋白結(jié)合水性質(zhì)的微弱不同可以分為結(jié)構(gòu)結(jié)合水和吸附結(jié)合水，T23是滯留于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中不易移動的水，T24為鴨血凝膠中的自由水。

表7 正交因素水平

表8 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

T2弛豫時間是對樣品內(nèi)部氫質(zhì)子所處化學環(huán)境的反映，它與氫質(zhì)子所受束縛力大小及其自由度有關(guān)。當氫質(zhì)子所受束縛越大或自由度越小，則T2弛豫時間越短，在T2譜上峰出現(xiàn)的位置越靠左；反之T2弛豫時間越長，峰位置則越靠右[11]。試驗組鴨血凝膠T23弛豫時間整體較空白組向左遷移，這說明添加TG酶處理后鴨血豆腐內(nèi)部的水分受到的束縛力增加，其中加入TG酶處理使T23和T24明顯降低，這表明不易流動水分子和自由水的移動性顯著降低，從而證明谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的加入促使水分結(jié)合地更緊密。

表9 處理方式對鴨血凝膠弛豫時間的影響?

? *表示與空白組比較，P<0.05。

鴨血凝膠保水性主要取決于不易移動水。鴨血豆腐保水性的變化也正是因為自由水減少、結(jié)合水上升所引起的。這可能是交聯(lián)過程中蛋白質(zhì)的親水基團暴露，使自由水轉(zhuǎn)化為不易移動水。如圖1所示，0.25%TG+40 ℃ 下保溫處理30 min的鴨血豆腐中自由水含量減少，結(jié)合水與不易移動水占比增加最為顯著。這是因為TG酶增加了蛋白之間的交聯(lián)，形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包合更多的水分，因此鴨血豆腐品質(zhì)也是最優(yōu)的。

(2) 全質(zhì)構(gòu)測定：由表10可知，第4組(0.25% TG+30 min)鴨血豆腐內(nèi)聚性和回復(fù)性分別為0.90和0.42，均達到最高水平，說明添加0.25% TG，保溫30 min促進了蛋白交聯(lián)，但又不至于過分交聯(lián)導(dǎo)致鴨血豆腐韌性過大，因此該處理方式下的鴨血豆腐的品質(zhì)優(yōu)于其他組。

0. 未添加TG未保溫 1. 0.20% TG+30 min 2. 0.20% TG+40 min 3. 0.20% TG+50 min 4. 0.25% TG+30 min 5. 0.25% TG+40 min 6. 0.25% TG+50 min 7. 0.30% TG+30 min 8. 0.30% TG+40 min 9. 0.30% TG+50 min

圖1 處理方式對各峰峰面積百分數(shù)的影響

? *表示與空白組比較，P<0.05。

(3) 微觀結(jié)構(gòu)：較強凝膠強度形成的原因是存在規(guī)則的結(jié)構(gòu)。由圖2可以觀察到天然狀態(tài)下形成的鴨血凝膠體系是由纖維蛋白形成的錯綜復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑較大、雜亂無章，水分容易滲漏。這種粗糙、不規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致不理想的硬度、口感。加入0.25% TG、40 ℃下保溫30 min的鴨血凝膠中蛋白質(zhì)交聯(lián)、堆積在自身凝膠體系中，形成更均一、緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，該凝膠結(jié)構(gòu)網(wǎng)孔變小，能夠有效包合水分，防止鴨血豆腐脫水皺縮[12]，也賦予產(chǎn)品較好的可塑性。

圖2 鴨血豆腐的掃描電鏡圖

Figure 2 Scanning electron micrographs of duck blood curd by different methods (×5 000)

3 結(jié)論

利用單因素試驗研究了加酶量、保溫時間對鴨血豆腐的質(zhì)構(gòu)、顏色、持水性等指標的影響，通過兩因素三水平正交試驗對條件進行優(yōu)化，確定最佳的酶處理方式為：添加0.25% TG并在40 ℃下保溫30 min。利用此優(yōu)化條件進行實驗驗證，最終所得鴨血豆腐的持水性提高、膠著性、內(nèi)聚性等質(zhì)構(gòu)特性得到明顯改善。食用膠具有改善蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的特性，后續(xù)可進一步探究谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與食用膠復(fù)配對鴨血豆腐品質(zhì)的影響。