SPME-GC-MS結(jié)合組學(xué)技術(shù)分析發(fā)酵椰奶特征風(fēng)味與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性

雷文平 周 輝 周杏榮 吳 坤吳 霓 宋艷菲 劉成國

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

椰子(Cocosnuciferal)屬棕櫚科，是一種單子葉植被，具有較高營養(yǎng)與藥用價(jià)值，椰汁與椰肉富含蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、維生素、鉀、鈣、鎂等營養(yǎng)物質(zhì)[1]； 有研究[2-4]表明椰子具有抗菌、預(yù)防糖尿病、抗癌等功效。有學(xué)者[5-7]研究了椰子相關(guān)發(fā)酵制品，但仍以牛乳為原料，向其中加入椰漿進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵；并且椰子制品主要包括椰子油、椰奶、椰子水和椰子肉等；而完全以椰漿作為原料的發(fā)酵制品以及利用SPME-GC-MS對(duì)其風(fēng)味成分的分析未見報(bào)道；因此，對(duì)椰漿發(fā)酵制品風(fēng)味成分鑒定有待進(jìn)一步研究。

固相微萃取—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)被廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味物質(zhì)的研究；氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)于高揮發(fā)性的小分子量與高沸點(diǎn)的大分子量的物質(zhì)具有較低檢出限，并且固相微萃取(SPME)技術(shù)允許在短時(shí)間內(nèi)以簡單的方式從固體和液體基質(zhì)中分離揮發(fā)性物質(zhì)[8-10]。目前，部分學(xué)者[11-13]利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)主要集中在對(duì)發(fā)酵制品風(fēng)味物質(zhì)的含量及種類等分析，并未將特征感官風(fēng)味與風(fēng)味成分結(jié)合起來分析相應(yīng)風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)的特征感官風(fēng)味，而利用SPME-GC-MS結(jié)合組學(xué)技術(shù)能較準(zhǔn)確分析發(fā)酵制品的特征感官風(fēng)味與風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性[14]。

本研究擬以發(fā)酵椰奶為主要研究對(duì)象，利用固相微萃取—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)發(fā)酵椰奶的風(fēng)味成分進(jìn)行分析，結(jié)合組學(xué)技術(shù)從感官和風(fēng)味物質(zhì)方面分析了發(fā)酵椰奶的特征風(fēng)味，并以原味椰奶和酸牛奶作對(duì)比。旨在為發(fā)酵椰奶風(fēng)味物質(zhì)組成的鑒定及相關(guān)品質(zhì)的改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佳樂椰漿：蘇門答臘SAMBU集團(tuán)；

酸牛奶：食品微生物實(shí)驗(yàn)室自制，制作方法參考文獻(xiàn)[15]；

直投式發(fā)酵劑(Directed vat set，DVS)Y428A、Y439B、Y429A：上海昊岳食品科技有限公司；

脫脂奶粉：太子奶集團(tuán)生物科技有限責(zé)任公司；

果膠：食品級(jí)，厚滿生物科技(上海)有限公司；

海藻酸丙二醇酯：食品級(jí)，鄭州億之源化工產(chǎn)品有限公司；

白砂糖：食品級(jí)，長沙尚杰食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：PUCHUN型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

生化培養(yǎng)箱：GZ-400-S型，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；

雙人單面垂直凈化工作臺(tái)：SW-CJ-2D型，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；

超級(jí)恒溫水浴鍋：601型，金壇市醫(yī)療器廠；

冷藏柜：SC-320D型，青島海爾股份有限公司；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：GCMS-QP2010型，島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵椰奶的制備 首先將椰漿預(yù)熱至(60±1) ℃，并向椰漿中加入果膠(0.3 g/L)、海藻酸丙二醇酯(0.9 g/L)以及白砂糖(80 g/L)，加水至所需用量，混合攪拌均勻，制備成椰奶；然后將上述椰奶在溫度60 ℃、壓力25 MPa的條件下進(jìn)行一級(jí)均質(zhì)處理2～3次；將均質(zhì)后的椰奶在溫度95 ℃條件下殺菌處理25 min；殺菌完成后冷卻至(35±2) ℃，在無菌條件下加入30 g/L的直投式發(fā)酵劑至椰奶中，并在溫度39 ℃的條件下發(fā)酵7～8 h，待達(dá)到凝固狀態(tài)，且酸度為55～65 °T時(shí)即為發(fā)酵終點(diǎn)。最后，將恒溫發(fā)酵后的產(chǎn)品迅速冷卻至10 ℃以下，放入0～4 ℃的冰箱冷藏后熟24 h。

1.3.2 感官特征分析 將制備完成的發(fā)酵椰奶，以及原味椰奶(按1.2.1制備而成的椰奶)和酸牛奶，參照GB/T 16291.1—2012的感官評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，組建10人的感官評(píng)定小組。感官評(píng)價(jià)所用的描述性感官詞，來源于感官分析術(shù)語[16]和相關(guān)文獻(xiàn)[17]詞匯。

1.3.3 風(fēng)味成分分析 將制備完成的發(fā)酵椰奶，以及原味椰奶和酸牛奶，利用固相微萃取—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行風(fēng)味成分分析。

1.3.4 感官特征評(píng)價(jià)方法 分別稱取20 g發(fā)酵椰奶、原味椰漿和酸牛奶放入3個(gè)品嘗杯中，對(duì)其進(jìn)行氣味、滋味感官評(píng)定。每次評(píng)定的樣品編號(hào)采用3位隨機(jī)數(shù)字。評(píng)定員品嘗完一個(gè)樣品后用礦泉水漱口，每個(gè)樣品重復(fù)3次。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(0～9分)：0分(無)；1～3分(較弱)；4～6分(中等強(qiáng)度)；7～9分(強(qiáng))。經(jīng)訓(xùn)練后樣品感官風(fēng)味特征描述詞為甜味、酸味、椰子味、奶香味、果香味、乳脂味、香草味、蒸煮味、醇香味、焦糖氣味[18]。

1.3.5 風(fēng)味成分測定方法

(1) 樣品萃取方法：稱取按1.3.1所制備發(fā)酵椰奶、原味椰奶和酸牛奶樣品各1 g，分別置于15 mL萃取瓶，旋緊萃取瓶蓋，溫度為50 ℃條件下處理30 min, 然后利用老化后的萃取頭在溫度為70 ℃條件下頂空吸附45 min，最后插入GC-MS進(jìn)樣口解吸1 min，拔出萃取頭進(jìn)行GC-MS分析。

(2) GC條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱箱升溫程序：初溫35 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min升溫至200 ℃，再以20 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；載氣為氦氣He，流速為1 mL/min；進(jìn)樣采用自動(dòng)分流方式進(jìn)行，分流比10∶1[19-20]。

(3) MS條件：EM電離源，離子源溫度250 ℃；接口溫度200 ℃；檢測電壓為1 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z為35～400[21-22]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性水平為P<0.05；利用R Studio軟件對(duì)樣品進(jìn)行(Principal component analysis，PCA)分析，并以O(shè)rigin Pro 2018軟件作圖；采用SIMCA-P 11.5分析軟件對(duì)發(fā)酵椰奶氣味感官數(shù)據(jù)與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行偏最小二乘法分析(Partial least squares regression，PLS)。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官風(fēng)味特征評(píng)定

通過對(duì)感官評(píng)定人員進(jìn)行培訓(xùn)后，對(duì)發(fā)酵椰奶、原味椰奶以及酸牛奶的感官風(fēng)味特征評(píng)定，評(píng)定的結(jié)果見表1。

表1 感官風(fēng)味特征評(píng)定結(jié)果?

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表1可知，發(fā)酵椰奶感官風(fēng)味特征在甜味、酸味、椰子味、奶香味、乳脂味以及醇香味感官評(píng)分較高，其評(píng)分皆>3.00。對(duì)于甜味，發(fā)酵椰奶感官評(píng)分(5.70±0.45)相對(duì)于原味椰奶(8.60±0.53)顯著降低，原因可能是微生物發(fā)酵后產(chǎn)酸，使得發(fā)酵椰奶甜酸比發(fā)生變化；而相比酸味，酸牛奶(8.20±0.63)比較顯著。對(duì)于椰子味，椰奶在發(fā)酵前后感官評(píng)分并無顯著變化，表明微生物發(fā)酵并未削弱其特有椰子風(fēng)味。同時(shí)，發(fā)酵椰奶在其它風(fēng)味特征上感官評(píng)分相比酸牛奶并無顯著差異，表明發(fā)酵椰奶既保留了椰子特有風(fēng)味，并且具備酸牛奶特有風(fēng)味特征。

2.2 感官風(fēng)味特征主成分分析

利用R Studio軟件對(duì)發(fā)酵椰奶、原味椰奶以及酸牛奶的風(fēng)味感官評(píng)分進(jìn)行主成分分析，其主成分載荷矩陣和PCA圖分別見表2及圖1。

對(duì)發(fā)酵椰奶、原味椰奶以及酸牛奶的風(fēng)味特征感官評(píng)分進(jìn)行主成分分析，前3個(gè)主成分特征值的累積貢獻(xiàn)率已達(dá)74.49%，能夠解釋原始變量絕大部分信息。由表2 可知，第1主成分(PC1)與甜味、酸味、椰子味以及香草味4個(gè)感官風(fēng)味特征有較大相關(guān)性，其載荷絕對(duì)值均>3.5，表明PC1可以看作基本感官風(fēng)味的代表。第2主成分(PC2)與奶香味、果香味和焦糖氣味3個(gè)感官風(fēng)味特征有較大正相關(guān)，其載荷絕對(duì)值均>4.0，表明PC2能夠代表風(fēng)味乳的特有風(fēng)味。第3主成分(PC3)與奶香味和蒸煮味呈較大負(fù)相關(guān)，其載荷絕對(duì)值均>4.5，表明PC3可以看作不愉快感風(fēng)味代表。

由圖1可知，發(fā)酵椰奶、原味椰奶和酸牛奶在距離上有明顯區(qū)分；發(fā)酵椰奶主要感官風(fēng)味特征比較豐富，其主要集中了焦糖氣味、果香味、奶香味、椰子味和醇香味等感官風(fēng)味特征；而原味椰奶和酸牛奶感官風(fēng)味較為單一，且均有不愉悅的感官風(fēng)味，分別為蒸煮味和酸味；同時(shí)，發(fā)酵椰奶處在原味椰奶和酸牛奶之間，進(jìn)一步說明發(fā)酵椰奶既有椰子固有風(fēng)味，也具備酸奶特征風(fēng)味。

表2 感官風(fēng)味特征主成分載荷矩陣

2.3 風(fēng)味成分測定

采用SPME頂空吸附收集，GC-MS法對(duì)發(fā)酵椰奶、原味椰奶和酸牛奶的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行測定，其揮發(fā)性風(fēng)味成分的總離子流圖見圖2，樣品中各類揮發(fā)成分的定性和相對(duì)定量結(jié)果如表3所示。

圖1 感官風(fēng)味特征PCA圖Figure 1 Principal component biplot of sensory flavor characteristics

圖2 發(fā)酵椰奶、原味椰奶與酸牛奶揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流圖

Figure 2 Total ion current chromatograms of volatile compounds of fermented coconut milk、natural coconut milk and yogurt

表3 不同樣品中揮發(fā)性成分?

? “-”表示樣品中該風(fēng)味化合物未檢測出。

由表3可知，發(fā)酵椰奶的風(fēng)味成分種類繁多，總共檢測出23種揮發(fā)性成分，其中酸類10種，醇類3種，酮類3種，醛類2種，酯類4種，其它化合物1種；原味椰奶總共檢測出18種揮發(fā)性成分，其中酸類7種，醇類2種，酮類2種，醛類1種，酯類6種；酸牛奶中總共檢測出21種揮發(fā)性成分，其中酸類9種，醇類2種，酮類4種，醛類2種，酯類4種。

酸類物質(zhì)主要表現(xiàn)在滋味上。己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸等酸類物質(zhì)相對(duì)含量較高，是影響二者滋味的重要風(fēng)味成分；而相對(duì)發(fā)酵椰奶而言，丁酸、戊酸、L-乳酸是發(fā)酵椰奶的特征酸味物質(zhì)，丁酸與戊酸使得發(fā)酵椰奶表現(xiàn)出奶油香味，L-乳酸是發(fā)酵椰奶中的主要呈味酸類，這些特殊酸類物質(zhì)賦予了發(fā)酵椰奶獨(dú)特的風(fēng)味[14]。

醇類物質(zhì)的風(fēng)味閾值較高，雖然對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，但是醇類可以轉(zhuǎn)化成酸[23]。發(fā)酵椰奶中醇類物質(zhì)的相對(duì)含量為6.575%，而原味椰奶和酸牛奶分別含有0.560%和5.135%；發(fā)酵椰奶中檢測出了14-甲基-8-十六碳烯-1-醇以及(+)-2,3-二氫香葉基香葉醇等醇類成分，而原味椰奶中幾乎未檢出。豐富的醇類物質(zhì)使發(fā)酵椰奶表現(xiàn)出典型的醇香味。

原味椰奶中酮類物質(zhì)含量相對(duì)較少(1.505%)，而酮類是酸牛奶的重要風(fēng)味物質(zhì)之一。具有奶油香味的3-羥基-2-丁酮作為酸奶制品中重要風(fēng)味成分，這一成分的檢測結(jié)果差別較大，發(fā)酵椰奶中相對(duì)含量比原味椰奶和酸牛奶分別高10.295%和7.605%[24]；2,3-戊二酮具有焦糖氣味，兼具堅(jiān)果果香；2-庚酮具有水果氣味。酮類物質(zhì)是由不飽和脂肪酸的氧化、熱降解, 氨基酸降解或微生物代謝產(chǎn)生，酮類揮發(fā)性化合物一般呈奶油味或果香味[25]。

醛類物質(zhì)的風(fēng)味閾值一般較低，是各種氧化風(fēng)味的來源[26]。發(fā)酵椰奶中醛類物質(zhì)的相對(duì)含量為2.270%，原味椰奶和酸牛奶中醛類物質(zhì)相對(duì)含量分別為0.325%和2.025%；壬醛具有類似蠟香、蜂蜜香風(fēng)味[26]，使得發(fā)酵椰奶風(fēng)味更加醇和。

酯類物質(zhì)是一種很重要的風(fēng)味物質(zhì)，椰子脂肪是酯類物質(zhì)的主要來源，主要是通過脂肪酸水解和微生物代謝產(chǎn)生[27]。發(fā)酵椰奶和原味椰奶的酯類物質(zhì)相對(duì)含量都比較高，分別為29.850%和40.520%；相比原味椰奶，發(fā)酵椰奶中酯類物質(zhì)含量明顯降低，這使得發(fā)酵椰奶滋味更加清淡柔和。

由表3還可知，含硫化合物在風(fēng)味物質(zhì)中很重要，風(fēng)味閾值比較低，發(fā)酵椰奶中檢出1種含硫化合物，而原味椰奶和酸牛奶中并無檢出。

2.4 發(fā)酵椰奶感官氣風(fēng)味特征與風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析

利用SIMCA-P 11.5分析軟件對(duì)發(fā)酵椰奶風(fēng)味感官數(shù)據(jù)與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行偏最小二乘法分析(PLS)，其PLS分析圖見圖3。

圖3 發(fā)酵椰奶感官氣味特征與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的PLS 分析圖

Figure 3 Linear partial least-squares regressionanalysibiplot of flavor zttributes and volatile flavor compounds of fermented coconut

由圖3可知，圖中包括2個(gè)變量，分別為感官風(fēng)味特征和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，二者的距離越相近，表明其相關(guān)性越好，解釋性越強(qiáng)[28]。圖中2,3-戊二酮、3-羥基-2-丁酮和2-壬酮等風(fēng)味物質(zhì)主要貢獻(xiàn)了果香味、奶香味和焦糖氣味，與陳娟等[26]描述較為一致；14-甲基-8-十六碳烯-1-醇和(+)-2,3-二氫香葉基香葉醇主要貢獻(xiàn)在醇香味上，且表3中二者相對(duì)含量也相對(duì)較高，進(jìn)一步表明醇香味主要由這2種物質(zhì)貢獻(xiàn)；酸味主要由丁酸、己酸等各種脂肪酸貢獻(xiàn)；癸酸乙酯、δ-葵內(nèi)酯、丁位壬內(nèi)酯、月桂酸乙酯等酯類主要貢獻(xiàn)了香草味、甜味、椰子味和蒸煮味。綜上所述，酮類物質(zhì)主要貢獻(xiàn)給發(fā)酵椰奶奶香味，酸味主要由脂肪酸貢獻(xiàn)；椰奶在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了不佳風(fēng)味如蒸煮味等，其與酯類化合物有密切關(guān)系。

3 結(jié)論

利用組學(xué)技術(shù)從感官和風(fēng)味物質(zhì)方面分析了發(fā)酵椰奶的特征風(fēng)味，并與原味椰奶和酸牛奶進(jìn)行對(duì)比。通過主成分分析表明發(fā)酵椰奶主要集中在甜味、酸味、椰子味、奶香味、乳脂味以及醇香味等感官風(fēng)味特征，其感官評(píng)分均>3；而相比原味椰奶，其感官風(fēng)味顯著得到改善，尤其消除了原味椰奶的蒸煮味。同時(shí)，發(fā)酵處理對(duì)原味椰漿風(fēng)味成分影響顯著，從發(fā)酵椰奶中共檢測出23種風(fēng)味成分，比原味椰奶和酸牛奶分別多5種和2種，相比原味椰奶，發(fā)酵椰奶中酸類和酯類成分顯著下降，而醇類、酮類和醛類成分明顯上升。進(jìn)一步結(jié)合感官風(fēng)味特征進(jìn)行PLS分析發(fā)現(xiàn)發(fā)酵椰奶中2,3-戊二酮、3-羥基-2-丁酮和2-壬酮等風(fēng)味物質(zhì)與果香味、奶香味和焦糖氣味相關(guān)性較強(qiáng)，而蒸煮味主要由酯類物質(zhì)貢獻(xiàn)，也說明通過發(fā)酵降低了酯類物質(zhì)成分，能改善原味椰漿的蒸煮味。本研究利用SPME-GC-MS結(jié)合組學(xué)技術(shù)分析發(fā)酵椰奶的特征感官風(fēng)味與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性，而在研究風(fēng)味物質(zhì)的形成機(jī)理以及相關(guān)感官風(fēng)味與風(fēng)味物質(zhì)聯(lián)系機(jī)制方面有待進(jìn)一步研究。