尖頂羊肚菌菌絲、分生孢子及原基顯微觀察與分析

石建森，郭明慧，陳淑霞

（山西省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，山西太原030031）

羊肚菌（Morchella spp.）是一種珍貴的食用菌，隸屬于子囊菌亞門（Ascomycota）盤菌綱（Discomycetes）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）。目前已在我國四川、湖北、山西等地開始大規(guī)模的人工種植，發(fā)展比較迅速。但是由于在羊肚菌方面的理論研究尚不夠深入，許多東西還不甚清楚，就在很大程度上限制了羊肚菌種植的工藝與水平，產(chǎn)量極不穩(wěn)定。

羊肚菌的分生孢子產(chǎn)生是羊肚菌栽培中一個特殊階段，有人已經(jīng)把分生孢子的數(shù)量與產(chǎn)量聯(lián)系起來，認為原基的形成數(shù)量與分生孢子的多少形成相關，沒有分生孢子就形不成原基[1-3]。但是有大量的試驗證實，直接從栽培土壤表面收集的分生孢子，在純培養(yǎng)或混合培養(yǎng)的條件下，不能萌發(fā)產(chǎn)生新的菌絲，推測分生孢子是羊肚菌真正的休眠體[4]。對于羊肚菌子實體的形成有人提出了不同的看法，認為羊肚菌子實體是由菌核發(fā)展而來的[5-7]，并詳細描述了由菌核到子實體形成的4個階段。VOLK等[8]在前者基礎上提出了完整的羊肚菌生活史，在這個假設的生活史中，菌核在子實體形成中的作用占據(jù)了主導位置。

本研究對尖頂羊肚菌（M.conica）菌絲、分生孢子及原基進行了詳細的顯微觀察，著重分析探討了分生孢子在原基的形成過程中所起的作用，對羊肚菌生活史提出了新的見解，使人們對羊肚菌生活史有一個更加科學的認識。

1 材料和方法

1.1 材料

供試栽培菌株尖頂羊肚菌8號來自山西省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所菌種保藏室。

1.2 栽培試驗

羊肚菌栽培試驗在山西省農(nóng)業(yè)科學院東陽試驗示范基地12號大棚進行。2017年12月20日播種，3 d后菌絲開始萌發(fā)，6 d后大量氣生菌絲形成，13 d后土壤表面產(chǎn)生大量分生孢子，特別是畦邊排水渠兩側見成片分生孢子聚集。2018年3月14日開始出菇，有大量原基產(chǎn)生。

1.3 顯微觀察

在各個階段分別取樣。菌絲取于畦上土壤表面，原基取于水渠邊分生孢子聚集區(qū)域，并在山西省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所實驗室進行光學顯微鏡觀察與拍照。

2 結果與分析

2.1 氣生菌絲的顯微觀察

羊肚菌播種后3 d就會萌發(fā)，在土壤中形成大量的菌絲，這些菌絲有一部分在土壤表面形成氣生菌絲，氣生菌絲在10～15 d就在土壤表面形成大量的分生孢子（圖1）。還有一部分菌絲深入土壤中形成基內(nèi)菌絲。

氣生菌絲根部粗，大部分處于40～70 μm，透明狀，偶有分枝、融合少，看不清菌絲細胞分隔與核相，也有少量很細的菌絲。氣生菌絲前段菌絲變細，分叉增多，菌絲直徑20～60 μm。去掉氣生菌絲，緊貼土壤表面發(fā)現(xiàn)一掃帚狀菌絲，主干最粗處600 μm，細處 240 μm，主干上分枝 60 μm。

2.2 基內(nèi)菌絲的顯微觀察

在土壤中發(fā)現(xiàn)的基內(nèi)菌絲與土壤表面的氣生菌絲有明顯的不同，不僅顏色深，呈淡黃色，而且韌性強，菌絲粗40～80 μm，這部分菌絲有大量的分叉與三角型聯(lián)結（圖2），筆者暫命名為活躍菌絲，推測其可能是羊肚菌菌絲分化出的不同于氣生菌絲的另一種菌絲。

2.3 分生孢子的顯微觀察

氣生菌絲前端分枝形成分生孢子梗，分枝菌絲20 μm左右，孢子梗更細，分生孢子輪生于孢子梗上，初期呈雪白色（圖3）。分生孢子在澆出菇水后，在畦邊排水渠邊上大片聚集。

2.4 原基的顯微觀察

2.4.1 栽培試驗的觀察結果 原基在水渠邊上分生孢子稠密區(qū)域大量發(fā)生，大小參差不齊，相差甚遠，在同一個區(qū)域呈現(xiàn)有針尖大小的、有米粒大小的、有黃豆大小的，還有剛開始分化的與分化已完成的。原基呈肉質，小時透明，稍大時頂部呈灰黑色。原基中也有呈乳白色的，觀察發(fā)現(xiàn)這種原基不能發(fā)育成子實體（圖4）。

試驗觀察發(fā)現(xiàn)，在種植區(qū)畦邊分生孢子越密集的區(qū)域原基發(fā)生的越多，分生孢子少的區(qū)域原基少，沒有分生孢子的區(qū)域不產(chǎn)生原基；分生孢子被移植到別的地方或被水沖到遠離種植區(qū)的地方，也不產(chǎn)生原基，這就表明了分生孢子與原基發(fā)生有密切的關系，而且只有分生孢子并不能形成子實體，這就暗示了原基的形成除了分生孢子還需要畦內(nèi)土壤中另一種元素的共同作用。

2.4.2 原基的發(fā)生與活躍菌絲的關系 對原基進行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，原基根部與活躍菌絲緊密相連，這種活躍菌絲粗約40 μm，有韌性，在近原基端呈微紅色，距離越近顏色越深，菌絲內(nèi)分隔清晰可見，常常呈叉狀（圖5）。與單個原基相連的活躍菌絲有的是1根，有的是2根，也有3根的，進入不同原基的活躍菌絲組成一個網(wǎng)絡，這種菌絲來自于土壤里面另一種區(qū)別于氣生菌絲的菌絲。還觀察到活躍菌絲進入原基處有的形成一個明顯的保護鞘。

原基根部有毛刷狀透明的細菌絲，菌絲粗20～10 μm，似初生根毛。推測這些毛刷狀菌絲是由活躍菌絲激發(fā)形成的，是以后形成龐大肉質假根的基礎。

通過大量的對原基及活躍菌絲的觀察，認為活躍菌絲在環(huán)境適宜的條件下與分生孢子發(fā)生了作用，促使分生孢子的膨大并與分生孢子相互作用才形成了原基，在這個過程中，分生孢子相當于卵子，活躍菌絲則擔當了精子的角色。

2.5 羊肚菌生活史新模型

基于大量的顯微觀察分析及相關的試驗，本研究提出一個新的羊肚菌生活史描述。羊肚菌生活史新模型（圖6）的要點在于：（1）羊肚菌菌絲在土壤中萌發(fā)并分化出2種菌絲，其中，一種是氣生菌絲，其在土壤表面形成單核的分生孢子[9-11]，另一種菌絲則是本研究所述的活躍菌絲。（2）由活躍菌絲作用于分生孢子，使分生孢子在適宜的環(huán)境下膨大分化成原基，分生孢子相當于卵子，活躍菌絲相當于精子。（3）在這個關于羊肚菌生活史的新模型中分生孢子占據(jù)重要的位置，與以前所沿用的以菌核為中心的羊肚菌生活史有本質的區(qū)別。

3 結論與討論

關于羊肚菌分生孢子人們已經(jīng)進行了大量的研究，CARRIS等[12]證實了斯萊德羊肚菌（M.cryptosph-aeria populina）白座焦孢（Diatrype stigma）的分生孢子不萌發(fā)。JACBOS等[13-14]對其細胞核進行染色分析，結果發(fā)現(xiàn)，它們的分生孢子均是單核狀態(tài)，細胞核幾乎完全充盈在鐮刀型的無性孢子內(nèi)，作者推測它們可能是扮演著不動精子的角色。國內(nèi)學者劉偉等[9]對梯棱羊肚菌分生孢子的觀察，也證明了分生孢子為單核，偶見2個或3～4個核，并且證明孢子內(nèi)有核分裂行為，但是沒有說明核分裂的具體時期。

本研究通過對羊肚菌原基的大量觀察發(fā)現(xiàn)了一種活躍菌絲的存在，而且推測羊肚菌的分生孢子只有在與這種菌絲發(fā)生了相互作用后才能萌發(fā)形成原基。OWER[15]及CARRIS等[12]的試驗證明至少4種羊肚菌的分生孢子單獨培養(yǎng)均不能萌發(fā)，也從側面支持了本試驗的研究結果。

本研究提出的羊肚菌生活史新模型能夠合理解釋分生孢子單獨培養(yǎng)不能萌發(fā)[12，16]，及分生孢子與子實體原基數(shù)量的相關性[1]等問題，但要搞清楚羊肚菌菌絲如何分化出活躍菌絲及活躍菌絲與分生孢子相互作用的詳細過程，還有待于進一步更加深入的研究。