油用牡丹籽粕低聚茋類化合物大孔樹脂富集與抑菌活性

王 露，趙笑笑，申少斐，牛顏冰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

牡丹為芍藥科芍藥屬，在我國種植歷史悠久，分布范圍廣。其不僅具有觀賞、藥用及文化價(jià)值，還是一種有較好經(jīng)濟(jì)效益的經(jīng)濟(jì)作物[1-2]。牡丹皮清熱涼血，活血祛瘀，且牡丹皮水煎劑對(duì)痢疾桿菌、傷寒桿菌等多種致病菌及致病性皮膚真菌均有抑制作用。牡丹籽油是一種新開發(fā)的食用木本植物油，不飽和脂肪酸含量豐富，營養(yǎng)價(jià)值高[3]。研究表明，若發(fā)生急性肝損傷，牡丹籽油有一定的保護(hù)作用[4]，牡丹籽油中的亞麻酸及其代謝物具有促進(jìn)大腦發(fā)育、預(yù)防心腦血管疾病的功效，具有非常高的藥用與保健價(jià)值[5]，另外，牡丹籽油還包含多種藥理活性物質(zhì)，具有抗炎、殺菌、降血糖和血脂及加強(qiáng)人體免疫力等功效[6-7]。

近年來，牡丹籽油日益受到人們的重視，但目前對(duì)壓榨牡丹籽油副產(chǎn)品牡丹籽粕的研究較少。牡丹籽粕中含有蛋白質(zhì)、牡丹皂苷、低聚茋類化合物、牡丹酚等保健物質(zhì)[8]，合理利用這些有效組分可以提高牡丹籽的利用率，解決牡丹籽粕造成的環(huán)境問題。尤其是低聚茋類化合物的研究，因其具有很好生物活性，包括抗菌、抗氧化、抗癌細(xì)胞等[1]，引起眾多學(xué)者的重視?，F(xiàn)在鮮有關(guān)于油用牡丹籽粕低聚茋類化合物提取富集工藝及抑菌活性研究。

本試驗(yàn)利用大孔樹脂對(duì)牡丹籽粕低聚茋類化合物粗提物進(jìn)行了純化，并對(duì)富集低聚茋類提取物進(jìn)行了抑菌活性研究，為高效利用油用牡丹資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試牡丹為山西汾河牡丹實(shí)業(yè)有限公司提供的油用牡丹鳳丹種子。

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）。

大孔吸附樹脂HPD-100，AB-8，購買于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 從牡丹籽粕中提取低聚茋類化合物 將干燥后的牡丹籽粉碎成粉過篩，利用閃式提取法脫脂[9]，制備所需粉末。參考文獻(xiàn)[1]，牡丹籽粕低聚茋類化合物的最佳提取工藝為：以40∶1的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，70℃下超聲提取40 min。本試驗(yàn)稱取10 g牡丹籽粕粉末，加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇400 mL（即40∶1 mL/g的液料比）后，在70℃的水浴溫度條件下，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（350 W）提取40 min。將獲得的粗提液用離心機(jī)離心8 min（3 000 r/min），然后輕取上清液，用數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃的條件下減壓蒸發(fā)，除去乙醇，將減壓蒸發(fā)剩下的稠狀物用50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液溶解，再用布氏漏斗抽濾，將濾液定容于250 mL的容量瓶中即可得到油用牡丹籽粕低聚茋類化合物的提取液，放入冰箱在4℃條件下避光保存[1]。

1.2.2 低聚茋類物質(zhì)含量的測(cè)定 按照Folin－Ciocalteu試劑法[10]測(cè)量牡丹籽粕內(nèi)低聚茋類化合物提取液的質(zhì)量濃度。將沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)比照物制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）用電子天平稱取0.5 g沒食子酸對(duì)照品粉末，用適量蒸餾水溶解，定容到100 mL。（2）先用移液管分別移取上述溶液 0，1.0，2.0，3.0，5.0，7.0 mL于6個(gè)100 mL容量瓶中，然后定容至100 mL，得到的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0，0.05，0.1，0.15，0.25，0.35 mg/mL[6，10]。（3）從配制好的標(biāo)準(zhǔn)液中，各移取1mL到6個(gè)標(biāo)記好的100mL容量瓶中，加入60mL蒸餾水搖勻，再用移液管各取5 mLFolin-Ciocalteu試劑混合均勻。（4）隨后在100 mL容量瓶中，各加入15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的碳酸鈉溶液，加蒸餾水定容到100 mL。20℃下避光放置0.5 h，在波長750 nm處用雙光束紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值。

1.2.3 大孔吸附樹脂型號(hào)選擇 參考文獻(xiàn) [11]，分別取經(jīng)過預(yù)處理的2種樹脂（HPD-100和AB-8）1.0 g，分開放入帶有標(biāo)記的細(xì)口瓶中，再向每個(gè)細(xì)口瓶中加入50 mL牡丹籽粕低聚茋類化合物的提取液，靜置吸附。12 h內(nèi)，每1 h攪拌一次，且每次持續(xù)3～5 min。然后用布氏漏斗對(duì)其進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)可加入定量（50 mL）的蒸餾水沖去樹脂表面殘留的藥液，測(cè)定并記錄母液量和殘液量以及吸附后的樹脂質(zhì)量，從而求得2種樹脂靜態(tài)比吸附量。

分別將上述吸附后的2種樹脂置于2個(gè)細(xì)口瓶中，分別加入60%的乙醇溶液50 mL，5 h內(nèi)每1 h攪拌一次，每次3～5min。再測(cè)洗出液中牡丹籽粕低聚茋類化合物的濃度，從而依公式求得靜態(tài)解吸率。

1.2.4 研究HPD-100型大孔樹脂吸附工藝

1.2.4.1 正交試驗(yàn) 通過查閱牡丹籽粕中低聚茋類化合物的相關(guān)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[8，12]與大孔樹脂的吸附特征[13]，本試驗(yàn)進(jìn)行了L9（34）正交試驗(yàn)。本試驗(yàn)考察了上柱液濃度、裝填樹脂徑高比、上樣的流速、最大上樣量4個(gè)因素，且每個(gè)因素分別取3個(gè)水平（表1）。試驗(yàn)通過測(cè)定牡丹籽粕低聚茋類物質(zhì)在流出液、上樣液和洗脫溶液中的含量，進(jìn)而依公式求得出動(dòng)態(tài)比吸附量。

表 1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平

1.2.4.2 泄漏試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5.0 g預(yù)處理過的HPD－100型大孔樹脂，將其裝入層析柱，以B3C1的工藝經(jīng)過樹脂。再用10 mL離心管收集流出液（10 mL/瓶）后測(cè)定各個(gè)離心管溶液中低聚茋類化合物的含量，作低聚茋類化合物的穿透曲線[11]，并求出飽和比吸附量。

1.2.5 優(yōu)化HPD-100型大孔樹脂洗脫工藝 水溶性雜質(zhì)的洗去：移液管量取50 mL低聚茋類化合物提取液以由正交試驗(yàn)得出的最佳吸附工藝水平進(jìn)行吸附，然后用蒸餾水沖洗大孔樹脂，用10 mL離心管連續(xù)收集12份流出液，作出蒸餾水對(duì)水溶性雜質(zhì)的洗脫曲線。

正交試驗(yàn)優(yōu)選洗脫工藝參數(shù)：同樣進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，嘗試考察乙醇的用量、乙醇的體積分?jǐn)?shù)與流速這3個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平（表2）。測(cè)量并記錄每次流出液內(nèi)低聚茋類物質(zhì)的質(zhì)量濃度和總固含物質(zhì)量，依公式求得比洗脫量（Y1）與茋類化合物純度（Y2）。

對(duì)求得比洗脫量和低聚茋類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化評(píng)分，100作為比洗脫量和茋類化合物純度的最高值，其他則依據(jù) Y'1＝Y(jié)1/Y1max×100，Y'2＝Y(jié)2/Y2max×100，求得相應(yīng)評(píng)分，再依據(jù)Y＝0.7Y'1＋0.3Y'2得綜合加權(quán)評(píng)分，再分析加權(quán)綜合得分[11]。

表2 洗脫工藝的參數(shù)

1.2.6 低聚茋類化合物抑菌活性試驗(yàn) 供試菌種的培養(yǎng)：（1）LB液體培養(yǎng)基的配制。分別準(zhǔn)確稱取酵母粉2.5 g、胰蛋白胨5 g、氯化鈉5 g放入燒杯中，加適量蒸餾水混勻后，用蒸餾水定容至500 mL，加入NaOH溶液用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH值到7.0。再將溶液分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50 mL，用封口膜和報(bào)紙進(jìn)行封口，并用立式高壓蒸汽滅菌鍋在121℃的條件下滅菌20 min即可。（2）LB固體培養(yǎng)基的配制。如液體培養(yǎng)基的操作，在調(diào)節(jié)pH值到7.0后，將溶液分裝到2個(gè)250 mL錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中加入3.75 g瓊脂粉[14]，用封口膜和報(bào)紙進(jìn)行封口，高壓蒸汽滅菌鍋在121℃的條件下滅菌20 min。當(dāng)溫度降低到七八十度時(shí)，在超凈工作臺(tái)進(jìn)行倒平板操作。0.5 h后將培養(yǎng)基倒放備用。（3）細(xì)菌的活化。取長期保存于試管的干燥大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌菌落，分別放入準(zhǔn)備好的LB液體培養(yǎng)基中，封口，37℃的搖床上振搖。在超干凈工作臺(tái)上，點(diǎn)燃酒精燈，將接種環(huán)灼燒滅菌后蘸取菌液（切記不可立即蘸取，以免高溫使菌種死亡），分別在LB固體培養(yǎng)基上劃線（每次劃線前接種環(huán)都要灼燒滅菌并冷卻）[15]。劃線結(jié)束后封口，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，30 min后將培養(yǎng)基倒置。過段時(shí)間觀察細(xì)菌生長情況，如果有菌落長出，用移液槍挑單個(gè)菌落到新的LB液體培養(yǎng)基中，封口后在37℃搖床振搖，待液體培養(yǎng)基渾濁后，置于4℃中備用。

抑菌活性的測(cè)定：借助大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌圈試驗(yàn)，可驗(yàn)證油用牡丹籽粕中的茋類提取物的抑菌性能[16]。在超凈工作臺(tái)進(jìn)行以下操作。（1）用打孔器打出多個(gè)無菌濾紙小圓片，將其浸泡在富集前后的牡丹籽粕低聚茋類化合物提取液和蒸餾水中，浸泡在蒸餾水中的小圓片用作空白對(duì)照。（2）把培養(yǎng)皿底部均分成3部分，用涂布棒分別將活化好的大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌均勻的涂布在LB固體培養(yǎng)基上（每次涂布前都需將涂布棒灼燒滅菌并冷卻），記號(hào)筆做標(biāo)記。（3）把浸泡好的小圓片按標(biāo)記放置于每個(gè)區(qū)域中心，可用鑷子輕輕按壓小圓片。封口后，放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.5 h后倒置。培養(yǎng)基上長出菌落后，測(cè)量抑菌直徑并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可知，以吸光度值為Y軸，沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為X軸作圖，得出本試驗(yàn)的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y＝0.093 4X＋0.004 6，R2＝0.999 6。從回歸方程可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在0.5～3.5 μg/mL的范圍內(nèi)呈線性。

2.2 2種類型大孔樹脂的比較

表3 2種樹脂對(duì)低聚茋類化合物提取液的靜態(tài)比吸附量和解吸附率結(jié)果

HPD-100型和AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)于低聚茋類化合物提取液的吸附與解吸附能力[17]如表3所示。由表3可知，HPD-100型樹脂吸附低聚茋類化合物的能力要比AB-8型樹脂高，且解吸率在90%以上，洗脫效果好。故本試驗(yàn)富集純化時(shí)選用HPD-100型大孔吸附樹脂。

2.3 HPD-100型大孔吸附樹脂的工藝研究

2.3.1 正交試驗(yàn) 由表4可知，直接比較4個(gè)因素的極差為RB＞RA＞RD＞RC，即上柱液濃度是影響試驗(yàn)結(jié)果的主要因子。比較同一因素的3個(gè)水平，可得 A1＞A2＞A3，B1＞B2＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D1＞D3，因此，可以得出最佳工藝為A1B1C2D2，即選擇徑高比1∶3，上柱液濃度1.15 mg/mL，上樣量最大是100 mL，流速 2 BV/h。

表 4 L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 在最佳工藝A1B1C2D2下重復(fù)3次試驗(yàn)，結(jié)果列于表5。由表5可知，平均動(dòng)態(tài)吸附量是49.58 mg/g，水平高且效果佳，故該工藝可被采用。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 mg/g

2.3.3 泄漏試驗(yàn) 由圖2可知，25管流出液被收集，其濃度變?yōu)?.49 mg/mL，近似于上柱液濃度，可看做大孔樹脂可以吸附250 mL上柱液，從而得出飽和比吸附量為28.45 mg/g。

2.4 HPD-100型大孔吸附樹脂洗脫工藝優(yōu)化

2.4.1 水溶性雜質(zhì)的洗去 由圖3可知，樣品中的水溶性雜質(zhì)隨蒸餾水份數(shù)的增多而不斷減少，12份流出液被收集后，累計(jì)流出液內(nèi)的水溶性雜質(zhì)百分率已經(jīng)達(dá)到87%，近似看作沖洗完全。故可得出，蒸餾水沖洗用量為120 mL。

2.4.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選洗脫工藝參數(shù) 由表6可知，極差Ra＞Rb＞Rc，故其影響因素主要是乙醇體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其次是乙醇用量與流速。方差分析得出，各水平與乙醇體積分?jǐn)?shù)（a）間有極顯著差異（P＜0.01），而 b，c兩因素間沒有顯著差異（P＞0.05）（表7）。故最優(yōu)洗脫條件是a3b3c3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，用量8 BV，流速3 BV/h。

表6 洗脫工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 以a3b3c3條件（最佳洗脫工藝）進(jìn)行洗脫（重復(fù)試驗(yàn)3次），結(jié)果如表8所示。由表8可知，比洗脫量為38.86 mg/g，依公式求得總茋類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.88%，表明a3b3c3洗脫工藝的重現(xiàn)性很好。

2.5 油用牡丹籽粕低聚茋類化合物提取物的抑菌活性研究

由表9和圖4可知，牡丹籽粕低聚茋類化合物提取物對(duì)細(xì)菌有一定的抑菌效果。菌種不同，富集前后的抑制效果也不相同。富集后的低聚茋類化合物提取液的抑菌效果普遍優(yōu)于富集前；在這3種細(xì)菌中，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯。

表7 方差分析

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 mg/g

表9 富集前后的低聚茋類化合物提取液對(duì)細(xì)菌的抑制作用（抑菌圈直徑） mm

3 討論

隨著生活質(zhì)量的提高，人們將日益親睞牡丹籽油，而牡丹籽油的副產(chǎn)品牡丹籽粕含有豐富的牡丹皂苷、牡丹多糖等營養(yǎng)保健物質(zhì)。充分利用牡丹籽粕中的有效組分可以增加牡丹籽的利用率。本試驗(yàn)對(duì)油用牡丹籽粕低聚茋類化合物提取物進(jìn)行了大孔吸附樹脂富集純化，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了研究，而之前的文獻(xiàn)中，大多一些是粗提物。因此，用本試驗(yàn)的方法可高效利用牡丹籽粕，并解決牡丹籽粕帶來的環(huán)境污染問題。在對(duì)牡丹籽油需求日益增長的情況下，分離純化油用牡丹籽粕低聚茋類物質(zhì)，采用HPD-100型大孔吸附樹脂有很好的應(yīng)用前景，同時(shí)也為油用牡丹資源的綜合開發(fā)和利用奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以牡丹籽粕低聚茋類化合物的粗提物為原料，采用大孔吸附樹脂富集純化牡丹籽粕中的低聚茋類化合物，結(jié)果表明，富集純化牡丹籽粕中低聚茋類物質(zhì)時(shí)，HPD-100型大孔吸附樹脂的純化效果比AB-8型大孔樹脂更佳，試驗(yàn)得出其最佳吸附工藝為：上樣液質(zhì)量濃度為1.15 mg/mL，上樣流速為2 BV/h，上樣量為100 mL，并且通過驗(yàn)證試驗(yàn)證明了該工藝的可行性；洗脫工藝最優(yōu)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，洗脫量為8 BV，洗脫速度為3 BV/h。驗(yàn)證試驗(yàn)證明，牡丹籽粕中低聚茋類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在最佳工藝下可達(dá)到39.52%。關(guān)于牡丹籽粕低聚茋類物質(zhì)抑制細(xì)菌活性能力的研究表明，低聚茋類化合物經(jīng)富集后得到的提取液的抑菌能力比富集前普遍要強(qiáng)；在大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌中，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯。