葉片直接PCR法在玉米轉(zhuǎn)基因快速檢測中的應用

趙冰兵 ，任 雯 ，周秒依 ，李韓帥 ，劉 亞 ，白琪林

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，山西太原030031；3.北京市農(nóng)林科學院玉米研究中心，北京100097）

玉米是全球第一大作物，是糧食、飼料、能源化工等行業(yè)的重要作物，其產(chǎn)量直接關系到國家的糧食安全[1]。1996年，轉(zhuǎn)基因玉米首次獲得商業(yè)化許可進行推廣，此后轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化種植面積逐年上升，到2017年，轉(zhuǎn)基因玉米的種植面積達到5 970萬hm2，僅次于轉(zhuǎn)基因大豆（9 410萬hm2）。隨著轉(zhuǎn)基因玉米占轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物比例不斷攀升，玉米轉(zhuǎn)基因品種的數(shù)量也越來越多[2]。而玉米轉(zhuǎn)基因檢測作為轉(zhuǎn)基因研究體系中的重要一環(huán)，其重要性不言而喻。轉(zhuǎn)基因玉米成分檢測對于鑒定轉(zhuǎn)基因玉米品種、對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行有效規(guī)范管理具有重要的現(xiàn)實意義[3]。

隨著轉(zhuǎn)基因技術的迅速發(fā)展，其配套的轉(zhuǎn)基因檢測技術也層出不窮，除了應用最為普遍的常規(guī)PCR方法，根據(jù)PCR原理技術又發(fā)展出一系列諸如多重PCR、復合PCR、數(shù)字PCR以及RT-PCK等轉(zhuǎn)基因檢測手段[4-10]。而在玉米轉(zhuǎn)基因檢測過程中使用最為普遍的常規(guī)PCR法檢測中使用CTAB法、SDS法等方法[11-12]提取制備DNA模板不僅是檢測的第1步，也是檢測中耗時耗力最多的一個環(huán)節(jié)。直接PCR技術的出現(xiàn)無疑是解決這一問題的一大突破。張晉強等[13]利用血液直接PCR法，建立了一種快速檢測豬嗜血支原體感染的方法；羅天寬等[14]采用水稻不同類型葉片作為PCR擴增模板，直接進行PCR反應，成功建立一種適用于水稻葉片檢測的直接PCR法；陸紹紅等[15]通過直接PCR法對血液中伊氏錐蟲感染進行了檢測，使該方法可以應用于伊氏錐蟲病的早期診斷以及現(xiàn)場調(diào)查；閔現(xiàn)華等[16]研究證明，直接PCR法可以作為一種高特異性、高靈敏度、簡便快捷的方法用于檢測番茄種子攜帶的番茄潰瘍病菌；邢珍娟等[17-18]以轉(zhuǎn)CP4-epsps基因玉米為材料，對直接PCR快速檢測方法在玉米檢測中的應用進行了初步探索，而該直接PCR方法在其他玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應用并不多見。

本研究以CC-2和2A-5這2種轉(zhuǎn)基因玉米樣品的葉片作為PCR反應模板，進行直接PCR反應，建立適用于玉米中轉(zhuǎn)基因成分檢測的直接PCR方法，并結(jié)合多重PCR技術，獲得一套檢測結(jié)果特異性高的直接PCR技術體系，用于快速篩查轉(zhuǎn)基因玉米。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因樣品材料為CC-2和2A-5；非轉(zhuǎn)基因樣品材料為京科968（對照）。

1.2 試驗試劑

Phire熱啟動II DNA聚合酶及dNTPs，購自Thermo公司；DNA分子量標記（100 bp DNA Marker），購自北京全式金生物科技公司。

1.3 引物設計

利用引物設計軟件Primer 5.0分別對CC-2和2A-5設計若干對事件特異性引物，根據(jù)玉米基因組序列及結(jié)構對設計的多對引物進行篩選及優(yōu)化，并參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)部關于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的相關法律法規(guī)[19]，最終確定一對用于本試驗的檢測引物（表1）。本試驗采用了葉綠體DNA中的高度保守基因IRB18基因設計引物作為對照引物[20]。試驗中所用引物均由北京擎科新業(yè)生物公司合成，引物終濃度為10 μmol/L。

表1 轉(zhuǎn)基因玉米檢測引物

1.4 試驗材料的準備

從2種轉(zhuǎn)基因玉米材料CC-2，2A-5及非轉(zhuǎn)基因玉米材料京科968中挑選籽粒飽滿、無損傷的種子，分別于培養(yǎng)箱內(nèi)浸泡6 h，30℃暗條件下進行發(fā)芽。48h后挑選發(fā)芽整齊一致的種子播種在23cm×16 cm規(guī)格的塑料盆內(nèi)。每盆播4粒種子。每個塑料盆內(nèi)填充1.8 kg壤土、0.7 kg蛭石（1∶1（V/V））及3.0 g的復合肥（有效含量45%）。

用打孔器于每個樣品植株幼苗葉片上取直徑為0.5 mm的葉片小塊備用；用取下的同一葉片其他部分進行DNA提?。ㄊ褂檬占噭┖刑崛》椒ǎ?。同時使用常規(guī)提取DNA模板進行PCR檢測試驗，作為同組樣品葉片直接PCR試驗的陽性對照。

1.5 PCR反應體系及條件

單重PCR反應體系總體積為20 μL：10 mmol/L Tris-HCl，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2，200 μmol/L dNTP each，正反向引物各 0.5 μL，1 U Phire熱啟動II DNA聚合酶0.4 μL，各成分配置完成后，以ddH2O補齊至20 μL體系。將切割好的0.5 mm的葉片小塊直接置于反應體系中，最好使葉片懸浮在反應體系中，葉片貼壁則會影響PCR反應結(jié)果。

單重PCR反應條件為：98℃預變性5 min；98℃變性5 s，62℃退火 5 s，72℃延長20 s，40個循環(huán)；72℃過度延伸1 min。

多重PCR反應體系使用降落PCR方法，用以提高產(chǎn)物特異性。PCR反應體系總體積為25 μL：10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP each，2 種檢測正反向引物各 0.5 μL，1 U Phire熱啟動 II DNA聚合酶 0.6 μL，2%DMSO，去離子水補充到25 μL。將切割好的0.5 mm的葉片小塊直接置于反應體系中。

多重PCR反應條件為：98℃預變性5 min；98℃ 變性5 s，65℃ 退火5 s，每循環(huán)降低1℃，72℃延長20 s，20個循環(huán)；72℃過度延伸1 min；98℃變性5 s，52℃退火 5 s，72℃延長20 s，20個循環(huán)；72℃過度延伸1 min。

1.6 PCR擴增產(chǎn)物

取PCR擴增產(chǎn)物各6 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為2%，電泳電壓100 V，電泳時間45 min；電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進行拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片直接PCR的對照反應

所有材料的葉片樣品都經(jīng)過葉綠體DNA基因IRB18檢測，均可擴增出長度為297 bp的特異性條帶，與IRB18基因條帶預期大小一致（圖1），且與使用傳統(tǒng)提取DNA模板進行PCR檢測的結(jié)果對比結(jié)果一致。表明此批樣品葉片可通過直接PCR方法進行轉(zhuǎn)基因檢測。

2.2 轉(zhuǎn)基因玉米事件特異性檢測

由瓊脂糖電泳結(jié)果（圖2～4）可知，CC-2，2A-5這2種轉(zhuǎn)基因材料的葉片通過直接PCR方法均擴增出與預期條帶大小一致的目的條帶，且目的條帶的特異性符合試驗要求（CC-2為292 bp，2A-5為214 bp）。

2.3 多重PCR檢測結(jié)果

瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示，CC-2和2A-5這2種轉(zhuǎn)基因事件在一次直接葉片PCR反應中得到了有效擴增（圖4）。由圖4可知，葉片直接PCR進行多重PCR檢測效果與常規(guī)DNA提取方法效果完全一致。使用待測樣品葉片進行直接PCR方法檢測，特異性強，具有可重復性，可以作為PCR檢測轉(zhuǎn)基因的新方法得到廣泛應用。

3 討論

隨著全球越來越多的轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)化生產(chǎn)應用，對轉(zhuǎn)基因檢測工作提出了更高的要求。因此，一種簡單、快速、高效的檢測方法對于檢測工作至關重要，也必然是轉(zhuǎn)基因檢測技術的發(fā)展趨勢。提取DNA耗時耗力，通常提取DNA的步驟所用時間是制約檢測效率和速度的主要環(huán)節(jié)，本研究通過對國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因玉米檢測方面現(xiàn)有方法的大量試驗和比對，選擇IRB18基因作為對照參考基因，將2種轉(zhuǎn)基因玉米事件分別進行PCR事件特異性檢測，建立了一套針對葉片PCR的玉米轉(zhuǎn)基因事件檢測反應體系和條件，現(xiàn)利用該方法檢測轉(zhuǎn)基因事件樣品及對照樣品均可擴增出符合IRB18基因大小的目的條帶，分別單獨檢測CC-2及2A-5的電泳圖中目的條帶清晰、特異性強，與國家標準檢測條帶大小一致。表明該方法可實際應用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測。

目前，隨著轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展、轉(zhuǎn)基因作物種類的增加，含有不同轉(zhuǎn)基因成分的混合樣品也在不斷增加，這就為轉(zhuǎn)基因檢測提出了更高的要求。為了進一步提高檢測效率，使用本試驗中建立的葉片PCR方法進行了多重PCR試驗，進一步驗證該檢測方法的有效性及高效性。由試驗結(jié)果可以觀測到，所選的2種轉(zhuǎn)基因玉米使用葉片直接PCR與多重PCR均獲得較為滿意的檢測結(jié)果，擴增條帶大小與預期一致，并且條帶清晰，特異性高，其中，多重PCR相較于普通PCR來說，具有更高的可靠性與更廣的適應性，能夠進一步簡化檢測流程，極大地提高檢測效率。

本研究可為轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測提供一個新的思路和參考。目前，很多實驗室及檢測相關部門常用的檢測方法是將需要檢測的樣品種子先進行萌發(fā)，然后取幼苗部分作材料進行DNA提取，最后用樣品DNA進行PCR擴增，獲得檢測結(jié)果，而這一系列過程花費的時間較長，應用本研究方法在一個較短的時間內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果，將大大地縮短檢測周期，提高檢測效率。使用多重降落PCR方法有助于更好地提高特異性。試驗證明，適當?shù)腜CR循環(huán)數(shù)有利于反應的順利進行，獲得不錯的PCR結(jié)果。試驗中還發(fā)現(xiàn)，進行40～45個循環(huán)獲得的擴增結(jié)果令人滿意。

但該方法在實際應用中還存在一些問題。老葉片及凍干葉片進行直接PCR效率不高，且條帶特異性不強。因此，目前該檢測方法仍需使用嫩葉片。此外，某些基因的轉(zhuǎn)化材料尚未找到可以進行直接PCR的引物。這些問題使該方法目前尚不能廣泛應用于大批量檢測及未知樣品檢測，仍需繼續(xù)進行大量的研究工作對該方法的操作及使用進行補充、改進和完善，使其在轉(zhuǎn)基因玉米檢測中發(fā)揮更大的作用。