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    MicroRNA-196a在喉癌組織中的表達(dá)及其 對喉癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

    2019-04-24 06:07:40馮國飛尤慧華張志鋒
    關(guān)鍵詞:小室喉癌細(xì)胞株

    馮國飛,尤慧華,張志鋒

    (金華市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉科,浙江 金華 321000)

    喉癌治療方法主要為手術(shù)和放化療為主的綜合性治療,而對于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的喉癌患者5年生存率和生活質(zhì)量較差。因此,探索治療喉癌的新方法具有重要意義[1]。MicroRNA(miRNA)在惡性腫瘤中發(fā)揮癌基因和抑制基因的作用,研究miRNA在惡性腫瘤中的表達(dá)可為惡性腫瘤的靶基因治療提供依據(jù)[2-3]。miR-196a在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常[4-5],可影響惡性腫瘤的侵襲和遷移,但miR-196a對喉癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響尚不清楚。本文探討miR-196a對喉癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及可能機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 標(biāo)本采集選取2015年1月—2017年12月金華市中心醫(yī)院70例喉癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本,術(shù)中采集每例患者喉癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣≥0.5 cm)于液氮中保存?zhèn)溆?。患者均?jīng)病理證實,術(shù)前未接受放化療等其他抗腫瘤治療,簽署知情同 意書。

    1.1.2 細(xì)胞株人喉癌Hep-2細(xì)胞株(美國菌種保藏中心)。

    1.1.3 主 要 試 劑Tanswell小 室、Matrigel膠、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶及BCA蛋白濃度測定試劑盒等購自美國Sigma公司,兔抗人磷脂酰肌 醇-3-激 酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)多克隆抗體、兔抗人磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-PKB)多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗體購自美國Gibco公司,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000及Trizol試劑盒購自美國Santa Cruze公司,miR-196a引物和內(nèi)參由上海天根生化科技有限公司設(shè)計并合成,pcDNA/miR-196a和pcDNA/miR-NC重組質(zhì)粒購自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理將人喉癌Hep-2細(xì)胞株接種到6孔板中,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞融合≥ 80%時將其分為空白對照組、陰性對照組及siRNA組,每組設(shè)7個復(fù)孔。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒,siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA/miR-196a,陰性對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA/miR-NC,空白對照組不做處理。轉(zhuǎn)染后再恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞備用。

    1.2.2 組織和細(xì)胞中miR-196a水平測定從液氮中取出喉癌組織和癌旁組織標(biāo)本各50 mg,充分研磨后加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min,提取喉癌組織和癌旁組織總RNA。取各組生長良好的喉癌細(xì)胞加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min,提取喉癌細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計測定RNA純度,取組織和細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,采用RT-PCR測定組織和細(xì)胞中miR-196a水平,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性10 s,60℃退火40 s,72℃延伸5 min,共35個循環(huán)。以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算組織和細(xì)胞中miR-196a水平。

    1.2.3 喉癌細(xì)胞侵襲能力測定取3組培養(yǎng)48 h的喉癌細(xì)胞置于EP管中(每組取1×105個細(xì)胞),加入培養(yǎng)基重懸。Transwell小室鋪Matrigel膠,重懸后的細(xì)胞置于Transwell小室中,在小室下層加入含胎牛血清的培養(yǎng)基,每組設(shè)7個復(fù)孔。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出小室,擦除小室內(nèi)細(xì)胞,染色固定,在顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況。

    1.2.4 喉癌細(xì)胞遷移能力測定取3組培養(yǎng)48 h的喉癌細(xì)胞加入到24孔Transwell小室的上室(每組取1×105個細(xì)胞)。將含血清培養(yǎng)基加入到小室的下室,每組設(shè)7個復(fù)孔,培養(yǎng)48 h后取出小室,進(jìn)行固定和染色,去除小室上層側(cè)位細(xì)胞,顯微鏡下觀察喉癌細(xì)胞遷移情況。

    1.2.5 喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平測定取各組培養(yǎng)48 h喉癌細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,介入離心管中,加入RIPA裂解液冰浴裂解30 min,提取喉癌細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白濃度試劑盒測定總蛋白純度。采用Western blotting檢測喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平。將蛋白提取液電泳分離,濕法轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉,加入一抗(一抗為兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人p-PKB多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體及GAPDH抗體)孵育24 h;加入二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG)孵育2 h,以GAPDH為內(nèi)參,用ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒進(jìn)行顯影。采用BioRad圖像分析系統(tǒng)測定各蛋白條帶吸光度,目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白的吸光度值/GAPDH蛋白吸光度值。

    1.2.6 喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平測定取各組培養(yǎng)48 h喉癌細(xì)胞,加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min,提取各組喉癌細(xì)胞總RNA。采用RT-PCR測定喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及 Bcl-2 mRNA水平,方法同1.2.5。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗或方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 喉癌組織和癌旁組織中miR-196a水平比較

    喉癌組織和癌旁組織中miR-196a水平分為別(1.87±0.13)、(1.00±0.02),經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=55.341,P=0.000);喉癌組織中miR-196a水平高于癌旁組織。見圖1。

    2.2 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株中miR-196a水平 比較

    圖1 喉癌組織和癌旁組織中miR-196a水平比較(n=70)

    空白對照組、陰性對照組及siRNA組喉癌Hep-2細(xì)胞株中miR-196a水平分別為(1.00±0.01)、(0.97±0.03)及(0.42±0.05)。3組喉癌Hep-2細(xì)胞株中miR-196a水平比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=639.800,P=0.000);siRNA組喉癌Hep-2細(xì)胞株中miR-196a水平低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),空白對照組與陰性對照組喉癌Hep-2細(xì)胞株中miR-196a水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    2.3 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移能力比較

    3組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移能力比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);siRNA組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),空白對照組與陰性對照組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖2、3。

    表1 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較(個,±s)

    表1 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較(個,±s)

    組別 侵襲細(xì)胞數(shù) 遷移細(xì)胞數(shù)空白對照組 185.26±21.35 213.24±24.35陰性對照組 182.37±22.56 211.17±23.54 siRNA組 98.19±11.47 107.46±12.07 F值 46.852 59.427 P值 0.000 0.000

    2.4 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平比較

    3組 喉 癌 細(xì) 胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);siRNA組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB及Bcl-2蛋白水平低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),而Bax水平高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)??瞻讓φ战M與陰性對照組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖4。

    圖2 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲能力(×200)

    圖3 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株遷移能力(×200)

    表2 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

    表2 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

    組別 PI3K蛋白 p-PKB蛋白 Bax蛋白 Bcl-2蛋白空白對照組 0.53±0.09 0.62±0.11 0.37±0.06 0.45±0.06陰性對照組 0.51±0.07 0.61±0.12 0.38±0.05 0.44±0.07 siRNA組 0.23±0.04 0.32±0.07 0.59±0.10 0.19±0.04 F值 40.466 19.417 20.130 45.119 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

    圖4 3組喉癌細(xì)胞中PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)

    2.5 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平比較

    空白對照組、陰性對照組、siRNA組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相 對 表 達(dá) 量 比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗,siRNA組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB及Bcl-2 mRNA水平低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),Bax mRNA水平高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),空白對照組與陰性對照組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

    表3 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

    表3 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

    組別 PI3K mRNA p-PKB mRNA Bax mRNA Bcl-2 mRNA空白對照組 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.01 1.00±0.02陰性對照組 1.01±0.02 1.00±0.01 1.03±0.02 0.98±0.01 siRNA組 0.48±0.07 0.54±0.08 1.76±0.14 0.42±0.05 F值 311.274 214.667 193.527 758.800 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

    3 討論

    miRNAs在人類和真核生物中廣泛存在,其為內(nèi)源性小分子非編碼RNA。在惡性腫瘤方面,miRNAs可作為癌基因或者抑癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-7]。miR-196a為miRNA家族成員之一,近年來在惡性腫瘤中的作用備受關(guān)注,其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮類似癌基因的作用[8],在胃癌、頭頸癌及肝癌等多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞中呈高表達(dá),可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,抑制惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡[9-10]。國外JIN等[11]研究發(fā)現(xiàn),miR-196a在喉癌中表達(dá)上調(diào),并通過下調(diào)喉癌中的p27kip1促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖。SAITO等[12]研究發(fā)現(xiàn),miR-196a在喉癌組織中表達(dá)上調(diào),有望成為喉癌的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點。國內(nèi)關(guān)于miR-196a在喉癌組織中表達(dá)的研究較少,本文對金華市中心醫(yī)院喉癌患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),miR-196a在喉癌組織中升高,與國外研究結(jié)果一致[11-12]。

    喉癌是頭頸部惡性程度比較高的惡性腫瘤之一,喉癌的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響喉癌治療和預(yù)后的主要因素。在喉癌的早期治療中,如能在消滅喉癌細(xì)胞的同時抑制喉癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,則對改善喉癌的預(yù)后具有重要意義。miR-196a與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。吳曉鵬等[13]研究發(fā)現(xiàn),miR-196a可通過抑制ANXA1等基因的表達(dá)參與食管癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。張健等[14]研究發(fā)現(xiàn),沉默miRNA-196a可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。目前國內(nèi)外關(guān)于miR-196a對喉癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移影響的研究較少,本研究發(fā)現(xiàn)沉默miR-196a可抑制喉癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移,表明miR-196a參與喉癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程,下調(diào)miR-196a有望成為防止喉癌轉(zhuǎn)移的靶點。

    喉癌的發(fā)生、發(fā)展受多種信號通路調(diào)控,PI3K/PKB信號通路在喉癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[15]。YANG等[16]發(fā)現(xiàn),PI3K/PKB/mTOR通路參與喉癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。miR-196a可通過PI3K/PKB信號通路參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。GUERRIERO等[17]研究發(fā)現(xiàn),miR-196a為肺癌細(xì)胞中異常PI3K/PKB信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)。SHANG等[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-196a過表達(dá)通過PTEN/PKB/FOXO1途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖,并抑制細(xì)胞凋亡。miR-196a是否通過PI3K/PKB信號通路參與喉癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移?本文研究發(fā)現(xiàn),沉默miR-196a可降低PI3K、p-PKB及Bcl-2水平,Bax水平升高。PI3K被激活后可催化產(chǎn)生PIP3,促使PKB被激活,激活的PKB激活其下游的靶基因,從而參與對細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用[19]。Bcl-2和Bax為PI3K/PKB信號通路的下游基因,Bcl-2為抑制細(xì)胞凋亡基因,Bax為促凋亡基因[20-21]。沉默miR-196a可降低喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB及Bcl-2水平,升高Bax水平,表明下調(diào)miR-196a水平可能通過PI3K/PKB信號通路及其下游的Bcl-2和Bax基因參與喉癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

    綜上所述,喉癌組織中miR-196a水平升高,下調(diào)miR-196a水平可抑制喉癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移,其機制可能為miR-196a通過PI3K/PKB信號通路及其下游靶基因抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

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