• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    MicroRNA-196a在喉癌組織中的表達(dá)及其 對喉癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

    2019-04-24 06:07:40馮國飛尤慧華張志鋒
    關(guān)鍵詞:小室喉癌細(xì)胞株

    馮國飛,尤慧華,張志鋒

    (金華市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉科,浙江 金華 321000)

    喉癌治療方法主要為手術(shù)和放化療為主的綜合性治療,而對于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的喉癌患者5年生存率和生活質(zhì)量較差。因此,探索治療喉癌的新方法具有重要意義[1]。MicroRNA(miRNA)在惡性腫瘤中發(fā)揮癌基因和抑制基因的作用,研究miRNA在惡性腫瘤中的表達(dá)可為惡性腫瘤的靶基因治療提供依據(jù)[2-3]。miR-196a在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常[4-5],可影響惡性腫瘤的侵襲和遷移,但miR-196a對喉癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響尚不清楚。本文探討miR-196a對喉癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及可能機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 標(biāo)本采集選取2015年1月—2017年12月金華市中心醫(yī)院70例喉癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本,術(shù)中采集每例患者喉癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣≥0.5 cm)于液氮中保存?zhèn)溆?。患者均?jīng)病理證實,術(shù)前未接受放化療等其他抗腫瘤治療,簽署知情同 意書。

    1.1.2 細(xì)胞株人喉癌Hep-2細(xì)胞株(美國菌種保藏中心)。

    1.1.3 主 要 試 劑Tanswell小 室、Matrigel膠、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶及BCA蛋白濃度測定試劑盒等購自美國Sigma公司,兔抗人磷脂酰肌 醇-3-激 酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)多克隆抗體、兔抗人磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-PKB)多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗體購自美國Gibco公司,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000及Trizol試劑盒購自美國Santa Cruze公司,miR-196a引物和內(nèi)參由上海天根生化科技有限公司設(shè)計并合成,pcDNA/miR-196a和pcDNA/miR-NC重組質(zhì)粒購自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理將人喉癌Hep-2細(xì)胞株接種到6孔板中,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞融合≥ 80%時將其分為空白對照組、陰性對照組及siRNA組,每組設(shè)7個復(fù)孔。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒,siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA/miR-196a,陰性對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA/miR-NC,空白對照組不做處理。轉(zhuǎn)染后再恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞備用。

    1.2.2 組織和細(xì)胞中miR-196a水平測定從液氮中取出喉癌組織和癌旁組織標(biāo)本各50 mg,充分研磨后加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min,提取喉癌組織和癌旁組織總RNA。取各組生長良好的喉癌細(xì)胞加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min,提取喉癌細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計測定RNA純度,取組織和細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,采用RT-PCR測定組織和細(xì)胞中miR-196a水平,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性10 s,60℃退火40 s,72℃延伸5 min,共35個循環(huán)。以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算組織和細(xì)胞中miR-196a水平。

    1.2.3 喉癌細(xì)胞侵襲能力測定取3組培養(yǎng)48 h的喉癌細(xì)胞置于EP管中(每組取1×105個細(xì)胞),加入培養(yǎng)基重懸。Transwell小室鋪Matrigel膠,重懸后的細(xì)胞置于Transwell小室中,在小室下層加入含胎牛血清的培養(yǎng)基,每組設(shè)7個復(fù)孔。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出小室,擦除小室內(nèi)細(xì)胞,染色固定,在顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況。

    1.2.4 喉癌細(xì)胞遷移能力測定取3組培養(yǎng)48 h的喉癌細(xì)胞加入到24孔Transwell小室的上室(每組取1×105個細(xì)胞)。將含血清培養(yǎng)基加入到小室的下室,每組設(shè)7個復(fù)孔,培養(yǎng)48 h后取出小室,進(jìn)行固定和染色,去除小室上層側(cè)位細(xì)胞,顯微鏡下觀察喉癌細(xì)胞遷移情況。

    1.2.5 喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平測定取各組培養(yǎng)48 h喉癌細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,介入離心管中,加入RIPA裂解液冰浴裂解30 min,提取喉癌細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白濃度試劑盒測定總蛋白純度。采用Western blotting檢測喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平。將蛋白提取液電泳分離,濕法轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉,加入一抗(一抗為兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人p-PKB多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體及GAPDH抗體)孵育24 h;加入二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG)孵育2 h,以GAPDH為內(nèi)參,用ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒進(jìn)行顯影。采用BioRad圖像分析系統(tǒng)測定各蛋白條帶吸光度,目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白的吸光度值/GAPDH蛋白吸光度值。

    1.2.6 喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平測定取各組培養(yǎng)48 h喉癌細(xì)胞,加入Trizol裂解液冰浴裂解10 min,提取各組喉癌細(xì)胞總RNA。采用RT-PCR測定喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及 Bcl-2 mRNA水平,方法同1.2.5。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗或方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 喉癌組織和癌旁組織中miR-196a水平比較

    喉癌組織和癌旁組織中miR-196a水平分為別(1.87±0.13)、(1.00±0.02),經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=55.341,P=0.000);喉癌組織中miR-196a水平高于癌旁組織。見圖1。

    2.2 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株中miR-196a水平 比較

    圖1 喉癌組織和癌旁組織中miR-196a水平比較(n=70)

    空白對照組、陰性對照組及siRNA組喉癌Hep-2細(xì)胞株中miR-196a水平分別為(1.00±0.01)、(0.97±0.03)及(0.42±0.05)。3組喉癌Hep-2細(xì)胞株中miR-196a水平比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=639.800,P=0.000);siRNA組喉癌Hep-2細(xì)胞株中miR-196a水平低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),空白對照組與陰性對照組喉癌Hep-2細(xì)胞株中miR-196a水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    2.3 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移能力比較

    3組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移能力比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);siRNA組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),空白對照組與陰性對照組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖2、3。

    表1 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較(個,±s)

    表1 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較(個,±s)

    組別 侵襲細(xì)胞數(shù) 遷移細(xì)胞數(shù)空白對照組 185.26±21.35 213.24±24.35陰性對照組 182.37±22.56 211.17±23.54 siRNA組 98.19±11.47 107.46±12.07 F值 46.852 59.427 P值 0.000 0.000

    2.4 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平比較

    3組 喉 癌 細(xì) 胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);siRNA組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB及Bcl-2蛋白水平低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),而Bax水平高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)??瞻讓φ战M與陰性對照組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖4。

    圖2 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株侵襲能力(×200)

    圖3 3組喉癌Hep-2細(xì)胞株遷移能力(×200)

    表2 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

    表2 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

    組別 PI3K蛋白 p-PKB蛋白 Bax蛋白 Bcl-2蛋白空白對照組 0.53±0.09 0.62±0.11 0.37±0.06 0.45±0.06陰性對照組 0.51±0.07 0.61±0.12 0.38±0.05 0.44±0.07 siRNA組 0.23±0.04 0.32±0.07 0.59±0.10 0.19±0.04 F值 40.466 19.417 20.130 45.119 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

    圖4 3組喉癌細(xì)胞中PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)

    2.5 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平比較

    空白對照組、陰性對照組、siRNA組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相 對 表 達(dá) 量 比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗,siRNA組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB及Bcl-2 mRNA水平低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),Bax mRNA水平高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),空白對照組與陰性對照組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

    表3 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

    表3 3組喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB、Bax及Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

    組別 PI3K mRNA p-PKB mRNA Bax mRNA Bcl-2 mRNA空白對照組 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.01 1.00±0.02陰性對照組 1.01±0.02 1.00±0.01 1.03±0.02 0.98±0.01 siRNA組 0.48±0.07 0.54±0.08 1.76±0.14 0.42±0.05 F值 311.274 214.667 193.527 758.800 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

    3 討論

    miRNAs在人類和真核生物中廣泛存在,其為內(nèi)源性小分子非編碼RNA。在惡性腫瘤方面,miRNAs可作為癌基因或者抑癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-7]。miR-196a為miRNA家族成員之一,近年來在惡性腫瘤中的作用備受關(guān)注,其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮類似癌基因的作用[8],在胃癌、頭頸癌及肝癌等多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞中呈高表達(dá),可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,抑制惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡[9-10]。國外JIN等[11]研究發(fā)現(xiàn),miR-196a在喉癌中表達(dá)上調(diào),并通過下調(diào)喉癌中的p27kip1促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖。SAITO等[12]研究發(fā)現(xiàn),miR-196a在喉癌組織中表達(dá)上調(diào),有望成為喉癌的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點。國內(nèi)關(guān)于miR-196a在喉癌組織中表達(dá)的研究較少,本文對金華市中心醫(yī)院喉癌患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),miR-196a在喉癌組織中升高,與國外研究結(jié)果一致[11-12]。

    喉癌是頭頸部惡性程度比較高的惡性腫瘤之一,喉癌的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響喉癌治療和預(yù)后的主要因素。在喉癌的早期治療中,如能在消滅喉癌細(xì)胞的同時抑制喉癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,則對改善喉癌的預(yù)后具有重要意義。miR-196a與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。吳曉鵬等[13]研究發(fā)現(xiàn),miR-196a可通過抑制ANXA1等基因的表達(dá)參與食管癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。張健等[14]研究發(fā)現(xiàn),沉默miRNA-196a可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。目前國內(nèi)外關(guān)于miR-196a對喉癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移影響的研究較少,本研究發(fā)現(xiàn)沉默miR-196a可抑制喉癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移,表明miR-196a參與喉癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程,下調(diào)miR-196a有望成為防止喉癌轉(zhuǎn)移的靶點。

    喉癌的發(fā)生、發(fā)展受多種信號通路調(diào)控,PI3K/PKB信號通路在喉癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[15]。YANG等[16]發(fā)現(xiàn),PI3K/PKB/mTOR通路參與喉癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。miR-196a可通過PI3K/PKB信號通路參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。GUERRIERO等[17]研究發(fā)現(xiàn),miR-196a為肺癌細(xì)胞中異常PI3K/PKB信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)。SHANG等[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-196a過表達(dá)通過PTEN/PKB/FOXO1途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖,并抑制細(xì)胞凋亡。miR-196a是否通過PI3K/PKB信號通路參與喉癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移?本文研究發(fā)現(xiàn),沉默miR-196a可降低PI3K、p-PKB及Bcl-2水平,Bax水平升高。PI3K被激活后可催化產(chǎn)生PIP3,促使PKB被激活,激活的PKB激活其下游的靶基因,從而參與對細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用[19]。Bcl-2和Bax為PI3K/PKB信號通路的下游基因,Bcl-2為抑制細(xì)胞凋亡基因,Bax為促凋亡基因[20-21]。沉默miR-196a可降低喉癌細(xì)胞PI3K、p-PKB及Bcl-2水平,升高Bax水平,表明下調(diào)miR-196a水平可能通過PI3K/PKB信號通路及其下游的Bcl-2和Bax基因參與喉癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

    綜上所述,喉癌組織中miR-196a水平升高,下調(diào)miR-196a水平可抑制喉癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移,其機制可能為miR-196a通過PI3K/PKB信號通路及其下游靶基因抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

    猜你喜歡
    小室喉癌細(xì)胞株
    日媒勸“灰小子”早日放開公主
    日本公主的準(zhǔn)婆家靠譜嗎?
    暢談(2018年6期)2018-08-28 02:23:38
    新型寬帶橫電磁波小室的設(shè)計
    缺氧誘導(dǎo)因子-1α在喉癌中的表達(dá)及意義
    穩(wěn)定敲低MYH10基因細(xì)胞株的建立
    Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
    喉癌組織中Survivin、MMP—2的表達(dá)、臨床意義及相關(guān)性研究
    穩(wěn)定抑制PAK2蛋白表達(dá)的HUH—7細(xì)胞株的建立
    ABCG2及其在喉癌中的研究進(jìn)展
    CYP2E1基因過表達(dá)細(xì)胞株的建立及鑒定
    www.精华液| 亚洲五月色婷婷综合| 2021少妇久久久久久久久久久| 少妇 在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 男人添女人高潮全过程视频| 黄色视频不卡| av网站免费在线观看视频| 欧美精品一区二区免费开放| 日本wwww免费看| 欧美精品av麻豆av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久热这里只有精品99| 老司机影院毛片| 免费看十八禁软件| 国产高清videossex| 美国免费a级毛片| 热re99久久精品国产66热6| 欧美精品高潮呻吟av久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产精品国产三级专区第一集| 爱豆传媒免费全集在线观看| 色播在线永久视频| 中文字幕亚洲精品专区| 视频区欧美日本亚洲| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 丁香六月欧美| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 黄片小视频在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲av男天堂| 丁香六月欧美| 少妇 在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美xxⅹ黑人| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 黄色毛片三级朝国网站| 999精品在线视频| 嫩草影视91久久| 亚洲av美国av| 两性夫妻黄色片| www.精华液| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲少妇的诱惑av| 90打野战视频偷拍视频| bbb黄色大片| 国精品久久久久久国模美| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲第一av免费看| 黄频高清免费视频| 日本wwww免费看| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美日韩黄片免| 午夜免费观看性视频| 久久中文字幕一级| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 99九九在线精品视频| 蜜桃国产av成人99| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产免费福利视频在线观看| 视频区图区小说| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲成人免费电影在线观看 | 国产成人av教育| 久久影院123| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美在线黄色| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 91字幕亚洲| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产成人啪精品午夜网站| 国产在视频线精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 天天添夜夜摸| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲国产欧美网| 悠悠久久av| 黄片小视频在线播放| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品久久久久成人av| 18禁观看日本| 国产成人精品在线电影| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 色视频在线一区二区三区| 亚洲专区国产一区二区| 考比视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 黄片播放在线免费| 亚洲欧美激情在线| 18禁国产床啪视频网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产视频一区二区在线看| 男女无遮挡免费网站观看| 性色av乱码一区二区三区2| 日韩制服骚丝袜av| 日韩电影二区| 青草久久国产| 久久精品国产综合久久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲国产av新网站| 美女福利国产在线| 一个人免费看片子| 国产熟女欧美一区二区| 国产成人91sexporn| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品一二三区在线看| 赤兔流量卡办理| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 99久久人妻综合| 看免费成人av毛片| 成年人黄色毛片网站| 欧美久久黑人一区二区| 国产成人欧美| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 美女大奶头黄色视频| 国产精品人妻久久久影院| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产爽快片一区二区三区| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲熟女精品中文字幕| 看免费av毛片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产一区二区激情短视频 | 欧美精品一区二区免费开放| 久久影院123| 久久久精品区二区三区| 国产91精品成人一区二区三区 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产人伦9x9x在线观看| 在线 av 中文字幕| 国产精品久久久人人做人人爽| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲国产欧美网| 精品人妻一区二区三区麻豆| 中文字幕人妻丝袜制服| 午夜久久久在线观看| 日本欧美国产在线视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日本色播在线视频| 咕卡用的链子| 午夜福利乱码中文字幕| 男人操女人黄网站| 亚洲国产欧美网| 精品亚洲成国产av| 母亲3免费完整高清在线观看| 午夜久久久在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美日本中文国产一区发布| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲av片天天在线观看| tube8黄色片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品一区二区在线不卡| 国产高清视频在线播放一区 | 又大又爽又粗| 国产成人免费观看mmmm| av国产久精品久网站免费入址| 午夜精品国产一区二区电影| 男女之事视频高清在线观看 | 黄色视频在线播放观看不卡| 午夜免费男女啪啪视频观看| av福利片在线| 亚洲精品国产av成人精品| 男女午夜视频在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲国产中文字幕在线视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 人妻一区二区av| 欧美精品一区二区免费开放| 男男h啪啪无遮挡| 嫩草影视91久久| 成在线人永久免费视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 97人妻天天添夜夜摸| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 久久青草综合色| 国产爽快片一区二区三区| 女人久久www免费人成看片| 黄色片一级片一级黄色片| 大片免费播放器 马上看| 麻豆乱淫一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 一级毛片我不卡| av在线老鸭窝| 1024视频免费在线观看| 一级毛片女人18水好多 | 嫁个100分男人电影在线观看 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| av在线播放精品| 999久久久国产精品视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 香蕉国产在线看| 国产男女内射视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 看免费成人av毛片| 精品久久蜜臀av无| 丰满少妇做爰视频| 成年动漫av网址| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲国产中文字幕在线视频| 中文字幕制服av| 国产av精品麻豆| av网站在线播放免费| 老司机靠b影院| 成人亚洲欧美一区二区av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产一级毛片在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产精品九九99| 国产黄色视频一区二区在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲第一av免费看| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲成人免费电影在线观看 | 欧美成人午夜精品| 国产成人精品久久二区二区91| 高清不卡的av网站| 人妻一区二区av| 成人三级做爰电影| 国产野战对白在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费观看人在逋| 精品少妇久久久久久888优播| 美女午夜性视频免费| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲三区欧美一区| 精品福利永久在线观看| 午夜日韩欧美国产| 熟女av电影| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品久久久久久精品古装| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人三级做爰电影| 午夜视频精品福利| 男女下面插进去视频免费观看| 久久综合国产亚洲精品| 搡老岳熟女国产| 国产色视频综合| av国产久精品久网站免费入址| 日韩欧美一区视频在线观看| 性少妇av在线| 国产精品一二三区在线看| 久久国产精品大桥未久av| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩av不卡免费在线播放| 午夜免费鲁丝| 欧美97在线视频| 亚洲av日韩在线播放| 欧美大码av| 18禁观看日本| 欧美xxⅹ黑人| 久久国产亚洲av麻豆专区| 成人国产一区最新在线观看 | 又黄又粗又硬又大视频| 黄片小视频在线播放| 日本vs欧美在线观看视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 深夜精品福利| 2018国产大陆天天弄谢| 在线观看一区二区三区激情| 18禁国产床啪视频网站| 极品人妻少妇av视频| 99热全是精品| 国产av精品麻豆| 成人影院久久| 一个人免费看片子| 久久性视频一级片| 一级毛片我不卡| 亚洲视频免费观看视频| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 女警被强在线播放| 下体分泌物呈黄色| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产一级毛片在线| 美女大奶头黄色视频| 亚洲av片天天在线观看| kizo精华| 91麻豆av在线| 午夜视频精品福利| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 大片免费播放器 马上看| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲精品乱久久久久久| 三上悠亚av全集在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 搡老岳熟女国产| 成年人黄色毛片网站| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美日本中文国产一区发布| 一级片'在线观看视频| 999久久久国产精品视频| 最近中文字幕2019免费版| 久久午夜综合久久蜜桃| 人妻 亚洲 视频| 免费在线观看黄色视频的| 99热全是精品| 欧美在线一区亚洲| 亚洲国产欧美网| 国产伦理片在线播放av一区| av网站在线播放免费| 亚洲专区中文字幕在线| 人成视频在线观看免费观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一区二区三区激情视频| 国产一卡二卡三卡精品| 免费看不卡的av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产午夜精品一二区理论片| 成人亚洲精品一区在线观看| 日韩制服骚丝袜av| av不卡在线播放| 波多野结衣av一区二区av| 国产免费现黄频在线看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品免费视频内射| www.999成人在线观看| 精品国产一区二区久久| 亚洲av片天天在线观看| 一个人免费看片子| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美国产精品一级二级三级| 老司机亚洲免费影院| av欧美777| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品一区二区免费欧美 | 日本vs欧美在线观看视频| 飞空精品影院首页| 叶爱在线成人免费视频播放| av网站在线播放免费| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 青春草视频在线免费观看| 视频在线观看一区二区三区| 欧美久久黑人一区二区| 中文字幕制服av| 色网站视频免费| 成人国产av品久久久| 国产视频首页在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲第一青青草原| 久久精品亚洲av国产电影网| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 另类精品久久| 这个男人来自地球电影免费观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 久久 成人 亚洲| 黄片小视频在线播放| 久久久国产一区二区| 男女午夜视频在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲黑人精品在线| 高清欧美精品videossex| 91精品三级在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久精品成人免费网站| 丝袜脚勾引网站| 99国产精品免费福利视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 性色av一级| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美日韩综合久久久久久| 黄色a级毛片大全视频| 久热这里只有精品99| 一级毛片 在线播放| 亚洲五月色婷婷综合| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲成色77777| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品.久久久| 国产免费视频播放在线视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一级黄片播放器| 18在线观看网站| 免费看av在线观看网站| 免费在线观看黄色视频的| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品亚洲av一区麻豆| 丝袜喷水一区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲,欧美精品.| 天堂8中文在线网| 国产精品九九99| 丰满少妇做爰视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日韩一区二区三区影片| 最黄视频免费看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲av成人精品一二三区| av在线app专区| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久欧美国产精品| 国产一区二区 视频在线| 在线天堂中文资源库| 99久久99久久久精品蜜桃| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 久久性视频一级片| 99久久人妻综合| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲第一av免费看| www.熟女人妻精品国产| 99国产精品免费福利视频| 黄色毛片三级朝国网站| 男女之事视频高清在线观看 | 看免费成人av毛片| 亚洲国产欧美网| 叶爱在线成人免费视频播放| 九色亚洲精品在线播放| 制服诱惑二区| 老熟女久久久| 婷婷丁香在线五月| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久热在线av| 亚洲av电影在线进入| 超碰成人久久| 日韩大码丰满熟妇| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 少妇的丰满在线观看| av视频免费观看在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 青青草视频在线视频观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 又黄又粗又硬又大视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 天天影视国产精品| 成人影院久久| 国产精品一区二区在线观看99| 免费日韩欧美在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 乱人伦中国视频| av网站在线播放免费| 久久av网站| 精品卡一卡二卡四卡免费| 51午夜福利影视在线观看| 国产视频一区二区在线看| 免费在线观看黄色视频的| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产高清国产精品国产三级| 性高湖久久久久久久久免费观看| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲人成电影观看| 好男人电影高清在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产伦理片在线播放av一区| av国产久精品久网站免费入址| av网站免费在线观看视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 国精品久久久久久国模美| 黄频高清免费视频| 亚洲精品在线美女| 日韩大片免费观看网站| 热99久久久久精品小说推荐| 国产成人免费无遮挡视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 啦啦啦啦在线视频资源| 七月丁香在线播放| 国产午夜精品一二区理论片| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 丝袜在线中文字幕| 婷婷丁香在线五月| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产黄频视频在线观看| 男女午夜视频在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 大香蕉久久网| 亚洲一区中文字幕在线| 美女主播在线视频| 日本欧美视频一区| 青青草视频在线视频观看| 久久中文字幕一级| 韩国高清视频一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区 | 午夜激情久久久久久久| 久久亚洲国产成人精品v| 国产1区2区3区精品| 国产成人精品久久久久久| 婷婷色av中文字幕| 少妇的丰满在线观看| 国产成人一区二区在线| 人妻人人澡人人爽人人| 国产精品偷伦视频观看了| 97在线人人人人妻| 亚洲精品国产一区二区精华液| 十八禁网站网址无遮挡| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费高清在线观看视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产男女内射视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产有黄有色有爽视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 免费在线观看完整版高清| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 黄色怎么调成土黄色| 久久人妻熟女aⅴ| 婷婷成人精品国产| 91麻豆av在线| 大香蕉久久网| 一二三四在线观看免费中文在| bbb黄色大片| 国产精品久久久人人做人人爽| 色播在线永久视频| 久久99精品国语久久久| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲三区欧美一区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 捣出白浆h1v1| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品秋霞免费鲁丝片| kizo精华| 欧美人与性动交α欧美软件| 日本色播在线视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜福利视频精品| 国产成人影院久久av| 波多野结衣av一区二区av| xxxhd国产人妻xxx| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品一区蜜桃| 色婷婷av一区二区三区视频| 热99久久久久精品小说推荐| 国产在视频线精品| 日本午夜av视频| 欧美黑人精品巨大| 精品卡一卡二卡四卡免费| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日日夜夜操网爽| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 精品久久蜜臀av无| www.av在线官网国产| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产成人91sexporn| 欧美人与善性xxx| 在线 av 中文字幕| 国产麻豆69| 尾随美女入室| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品国产一区二区久久| 久久av网站| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日韩伦理黄色片| 午夜福利一区二区在线看| 一本久久精品| 成人黄色视频免费在线看| 美女中出高潮动态图| 好男人视频免费观看在线| av网站免费在线观看视频| 亚洲图色成人| 久久综合国产亚洲精品| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 男女午夜视频在线观看| 看免费av毛片| 国产黄色免费在线视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产1区2区3区精品| 一区二区三区精品91| 精品国产一区二区三区四区第35| 大片免费播放器 马上看| 制服诱惑二区| 国产av一区二区精品久久| 91九色精品人成在线观看| 婷婷色综合大香蕉| kizo精华| 曰老女人黄片|