高壓氧對(duì)糖尿病大鼠認(rèn)知功能及NGF mRNA表達(dá)的影響

王風(fēng)波，魏曉霏，王科，唐明薇

（成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610500）

2型 糖 尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM）認(rèn)知功能受損如未得到有效干預(yù)，可逐漸演變?yōu)槿烁窀淖兒蜕罨顒?dòng)能力缺失，甚至癡呆癥[1]。研究證實(shí)，T2DM可導(dǎo)致腦組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor,NGF）缺失[2]。高壓氧療法廣泛應(yīng)用于各種腦損傷，但目前尚未查及國(guó)內(nèi)外高壓氧對(duì)T2DM認(rèn)知功能及腦組織NGF影響作用的相關(guān)報(bào)道。本研究首次采用高壓氧對(duì)T2DM大鼠進(jìn)行治療性干預(yù)，旨在探討T2DM腦組織中NGF microRNA（NGF mRNA）表達(dá)與認(rèn)知功能的關(guān)系，為高壓氧治療T2DM腦病提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

48只健康成年SD大鼠，體重240～280 g，由成都醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SYXK（川）2015-196，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組（12只）、T2DM模型組（36只）。模型復(fù)制成功后，T2DM模型組大鼠再次按隨機(jī)數(shù)字表法分為非干預(yù)A組（6只）、非干預(yù)B組（12只），以及高壓氧A組（6只）、高壓氧B組（12只）。注射鏈脲佐菌素10 d后，非干預(yù)A組、高壓氧A組大鼠行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)知功能；空白對(duì)照組、非干預(yù)B組、高壓氧B組各隨機(jī)取6只 大鼠腦組織檢測(cè)NGF mRNA。高壓氧療程結(jié)束，非干預(yù)A組、高壓氧A組再次行認(rèn)知功能測(cè)驗(yàn)；空白對(duì)照組、非干預(yù)B組、高壓氧B組檢測(cè)NGF mRNA。

1.2 材料及主要設(shè)備

Trizol、DEPC及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma公司）,實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物高壓氧艙（煙臺(tái)宏遠(yuǎn)氧業(yè)有限公司G2-Y900-002型），Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（上海吉量科技有限公司）。

1.3 T2DM模型復(fù)制

T2DM模型組大鼠置于（25±2）℃室溫適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，測(cè)得尾靜脈血空腹血糖≤5.5 mmol/L，復(fù)制T2DM大鼠模型[3]：高糖高脂飲食飼養(yǎng)4周，禁食、不禁水12 h，經(jīng)腹腔單次注入1%鏈脲佐菌素（35 mg/kg），3 d后測(cè)得尾靜脈隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，確定模型復(fù)制成功。

1.4 高壓氧治療

注射后15 d開(kāi)始，每天定時(shí)將高壓氧A、B組大鼠置入高壓氧艙，純氧洗艙10 min后設(shè)置20 min內(nèi)勻速加壓至2.5個(gè)絕對(duì)大氣壓，穩(wěn)壓吸純氧40 min，20 min勻速減壓出艙，1次/d，共20 d[4]?？瞻讓?duì)照組及非干預(yù)A、B組大鼠不予任何干預(yù)。

1.5 Morris水迷宮認(rèn)知功能測(cè)驗(yàn)

Morris水迷宮認(rèn)知功能測(cè)驗(yàn)包括：①定位航行實(shí)驗(yàn)。大鼠先連續(xù)訓(xùn)練3 d，3次/d，平臺(tái)保持固定位置，訓(xùn)練結(jié)束次日記錄大鼠120 s內(nèi)從入水到爬上平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間，為逃避潛伏期；②空間探索實(shí)驗(yàn)。第 5天去除平臺(tái)，隨機(jī)選擇訓(xùn)練象限，將大鼠面壁置入水池，記錄大鼠120 s內(nèi)自由穿越虛擬平臺(tái)的次數(shù)。定位航行考察大鼠學(xué)習(xí)能力，空間探索考察大鼠空間記憶 能力[5]。

1.6 腦組織NGF mRNA檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[6]及試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用RT-PCR檢測(cè)大鼠腦組織NGF mRNA。大鼠麻醉后處死取腦組織，采用Trizol法提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。NGF正 向 引 物：5’-GCTGCACGTAGCCACCGGAC-3’，反 向 引 物：5’-GCAGCTAGTGCTGCCGTCTA-3’；β-actin為內(nèi)參定量分析NGF mRNA，β-actin正向引物：5’-GCGTGATCGCTGCGAGAC-3′，反向引物：5’-CCGCGGTCGCACTCGATAC-3’。PCR反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析或t檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般及血糖情況

T2DM模型大鼠反應(yīng)變慢，皮毛光澤下降，出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象，消瘦、精神狀態(tài)變差等，高壓氧治療后，大鼠上述癥狀有所改善。

2.2 高壓氧A組與非干預(yù)A組大鼠認(rèn)知功能比較

高壓氧治療20 d后，高壓氧A組與非干預(yù)A組逃避潛伏期比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高壓氧A組較短；高壓氧A組與非干預(yù)A組穿越虛擬平臺(tái)次數(shù)比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高壓氧A組次數(shù)較多。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠逃避潛伏期、穿越虛擬平臺(tái)次數(shù)比較（n=6，±s）

表1 兩組大鼠逃避潛伏期、穿越虛擬平臺(tái)次數(shù)比較（n=6，±s）

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2.3 各組大鼠腦組織NGF mRNA水平比較

治療前，空白對(duì)照組、非干預(yù)B組、高壓氧B組腦組織NGF mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，非干預(yù)B組、高壓氧B組低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。高壓氧治療20 d后，空白對(duì)照組、非干預(yù)B組、高壓氧B組腦組織NGF mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，高壓氧B組高于非干預(yù)B組和空白對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠腦組織NGF mRNA水平比較 （n=6，±s）

表2 3組大鼠腦組織NGF mRNA水平比較 （n=6，±s）

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與非干預(yù)B組比較，P＜0.05

組別 治療前 治療20 d空白對(duì)照組 0.93±0.47 0.97±0.14非干預(yù)B組 0.31±0.641） 0.29±0.87高壓氧B組 0.34±0.591） 0.78±0.612）F值 41.639 35.258 P值 0.000 0.000

3 討論

大量研究證實(shí)，糖尿病患者是血管性癡呆和阿爾茨海默病（Alzheimer disease,AD）的高危人群，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶、思維、邏輯等能力衰退，T2DM是主要的糖尿病類型，隨著病情發(fā)展，患者可出現(xiàn)行為異常，甚至喪失社會(huì)參與能力[7]。本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂+鏈脲佐菌素腹腔注射復(fù)制T2DM大鼠模型，模擬人類T2DM發(fā)病進(jìn)程。Morris水迷宮測(cè)驗(yàn)顯示，T2DM模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，腦組織NGF mRNA表達(dá)水平下降，提示模型復(fù)制成功。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)20 d高壓氧治療，大鼠血糖降低，糖尿病癥狀改善，逃避潛伏期縮短，穿越虛擬平臺(tái)次數(shù)增多，較非干預(yù)組明顯改善，說(shuō)明高壓氧對(duì)T2DM認(rèn)知功能障礙的康復(fù)起積極作用。其機(jī)制可能為[8-9]：①調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝，改善腦組織微循環(huán)及細(xì)胞代謝，有利于腦高級(jí)功能恢復(fù)；②提高腦組織氧自由基清除能力，抑制炎癥反應(yīng)，改善腦細(xì)胞腫脹變性；③調(diào)節(jié)神經(jīng)活性物質(zhì)表達(dá)水平，促進(jìn)腦細(xì)胞及髓鞘的修復(fù)；④提高機(jī)體氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)免疫功能，抑制細(xì)胞凋亡。

NGF是重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一。近年來(lái)研究證實(shí)，缺血性和出血性腦損傷的腦組織NGF陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，NGF mRNA表達(dá)上調(diào)，有利于防止神經(jīng)元死亡，改善神經(jīng)系統(tǒng)的病理變化，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的再生與修復(fù)[10-11]。AD模型大鼠接受NGF移植入海馬區(qū)，其神經(jīng)行為學(xué)得到顯著提高[12]。近年來(lái)高壓氧治療糖尿病并發(fā)癥獲得較好療效，有報(bào)道稱連續(xù)40 d高壓氧治療后，糖尿病周圍神經(jīng)病變患者四肢疼痛癥狀緩解，肢體運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度改善優(yōu)于對(duì)照組[13]。糖尿病足患者經(jīng)高壓氧治療后創(chuàng)面愈合情況明顯改善，血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子水平升高[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T2DM模型大鼠NGF mRNA表達(dá)水平低于空白對(duì)照組，說(shuō)明T2DM可顯著降低腦組織NGF的合成。參照人類高壓氧治療模式，對(duì)T2DM大鼠進(jìn)行2個(gè)療程共20 d的高壓氧治療，治療結(jié)束后大鼠腦組織NGF mRNA表達(dá)水平高于非干預(yù)組，說(shuō)明高壓氧療法可促進(jìn)腦組織NGF合成、代謝，提高表達(dá)水平，有利于腦細(xì)胞及神經(jīng)軸突的損傷后修復(fù)，進(jìn)而改善學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能。NGF對(duì)腦高級(jí)功能的積極作用可能與其特有的神經(jīng)保護(hù)生物活性有關(guān)，如抑制超氧自由基、毒性氨基酸的釋放及腦細(xì)胞凋亡等[14-15]。盡管糖尿病認(rèn)知功能障礙越來(lái)越受到學(xué)者及醫(yī)務(wù)工作者的重視，但目前治療方式仍較局限，主要依靠藥物及認(rèn)知訓(xùn)練、作業(yè)療法等康復(fù)治療技術(shù)。高壓氧療法能否作為常規(guī)治療手段長(zhǎng)期介入，本研究或許能提供較堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。