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    活性維生素D3對阿霉素腎病大鼠CD2AP的影響

    2019-04-24 06:07:34陳亞茹趙丹楊曉萍羅星劉馨馨馬國英
    關(guān)鍵詞:尿蛋白腎小球腎病

    陳亞茹,趙丹,楊曉萍,羅星,劉馨馨,馬國英

    (1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832002;2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆 石河子 832002)

    慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD)是以腎功能損害、蛋白尿排泄率升高為主要特征的臨床常見疾病[1]。近年來,隨著對CKD尿蛋白分子機制的深入研究,發(fā)現(xiàn)腎足細(xì)胞表面維生素D受體是活性維生素D3發(fā)揮抗蛋白尿的重要靶點[2]。CD2相關(guān)蛋白(CD2AP),作為足細(xì)胞標(biāo)志分子,具有維持細(xì)胞良好形態(tài),調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、凋亡及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能[3]。本實驗研究骨化三醇對阿霉素(Adriamyicin,ADR)腎病大鼠足細(xì)胞CD2AP表達(dá)的影響,探討活性維生素D3的腎保護(hù)作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    90只6周齡雄性SPF級健康Sprasue-Dawley大鼠,體重(200±20)g,由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2013-0001。

    1.2 實驗試劑及儀器

    1.2.1 主要試劑ADR(深圳萬樂藥業(yè)有限公司,批號:1409E1),骨化三醇(上海羅氏制藥有限公司,批號:J20150011),CD2AP兔多克隆抗體(美國Bioworld Technology公司),GAPDH鼠單抗(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),蛋白預(yù)染Marker 26616(美國Thermo Fisher Scientific公司),免疫組織化學(xué)染色二步法檢測試劑盒(北京中杉橋生物技術(shù)有限公司)。

    1.2.2 實驗儀器全自動生化分析儀BC6800(深圳邁瑞醫(yī)療國際有限公司),透射電子顯微鏡(日本Olympus Optical公司),電泳及電轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司),Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

    1.3 動物模型的復(fù)制及分組

    采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠經(jīng)單次尾靜脈注射ADR 7.5 mg/kg復(fù)制模型,另取30只為對照組。2周后,3組隨機選取6只大鼠檢測24 h尿蛋白、血清總蛋白(total protein,TP)、血漿白蛋白(plasma albumin,ALB)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、血清肌酐(serum creatinine,Scr)水平,判斷模型是否復(fù)制成功。將模型復(fù)制成功的SD大鼠隨機均分為模型組和治療組。治療組給予0.25μg/(kg·d)骨化三醇灌胃治療,對照組、模型組給予等量花生油灌胃。模型復(fù)制成功后每2周每組取6只大鼠檢測24 h尿蛋白,取腎組織冷凍保存。第10周實驗結(jié)束。

    1.4 觀察指標(biāo)

    1.4.1 尿蛋白、血生化檢測治療2、4、6、8和 10周后代謝籠留24 h尿,檢測24 h尿蛋白。經(jīng)大鼠腹主動脈采血,用全自動生化分析儀檢測TP、ALB、TC、Scr水平。

    1.4.2 Masson染色將4μm厚的大鼠腎組織石蠟切片梯度酒精脫蠟、脫二甲苯處理。經(jīng)核染液染色60 s,漿染液染色30~60 s,黃色分色液分色6~8 min,直接用苯藍(lán)/光綠液復(fù)染5 min左右,梯度酒精脫水,晾干,中性樹膠封片。

    1.4.3 透射電子顯微鏡實驗結(jié)束時,各組隨機選取 3只大鼠取其新鮮腎皮質(zhì)約1 mm×1 mm×1 mm,經(jīng)2.5%戊二醛初固定,1%鋨酸再固定,脫水、包埋、半薄切片、定位修塊,超薄切片機制成50~60 nm的超薄切片,經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色,封片、鏡檢、攝像。

    1.4.4 免疫組織化學(xué)染色將4μm厚的腎組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、微波高溫抗原修復(fù),3%過氧化氫內(nèi)源性過氧化物酶封閉,滴加CD2AP(1∶400)4℃孵育過夜,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)二抗,PBS漂洗3次,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,透明,封片。每張切片隨機選取5個腎小球視野,根據(jù)腎小球和腎小管間質(zhì)單位內(nèi)陽性信號面積與總面積的比值,計算CD2AP表達(dá)水平。

    1.4.5 Western blotting檢 測從-80℃冰 箱 取 出100 mg腎組織,加1 ml裂解液研磨(裂解液在使用前按1∶100比例加入10μl PMSF),所有操作在冰上進(jìn)行。研磨充分,取上清用BCA法測定蛋白濃度,配平。加入蛋白上樣緩沖液,100℃煮8 min,上樣量50μg/孔。SDS-PAGE電泳濃縮膠:83 V,30 min;分離膠:100 V,1 h;電轉(zhuǎn):23 V,100 min;5%脫脂奶粉封閉2 h,滴加一抗(CD2AP 1∶1 000,GAPDH 1∶1 000)4℃孵育過夜,TBST洗,CD2AP山羊抗兔二抗(1∶5 000)和GAPDH山羊抗小鼠二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h,TBST洗二抗,用ECL發(fā)光試劑暗室曝光,Image Lab系統(tǒng)圖像攝取,以GAPDH作為內(nèi)參。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗或單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠一般情況

    注射ADR后2周,模型組與對照組2周后大鼠24 h尿蛋白和血生化檢測結(jié)果比較,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);模型組TP、ALB低于對照組,24 h尿蛋白、Scr、TC高于對照組,提示模型復(fù)制成功(見表1)。對照組大鼠被毛有光澤,精神狀況良好,作息較規(guī)律;模型組毛皮暗淡無光,易嗜睡,反應(yīng)遲緩,飲食欠佳;治療組較模型組飲食、精神狀態(tài)均有不同程度改善。

    2.2 各組大鼠的24 h尿蛋白比較

    實驗前,3組大鼠24 h尿蛋白比較,經(jīng)單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.369,P=0.697),具有可比性。對照組、模型組、治療組大鼠活性維生素D3治療2、4、6、8和10周后24 h尿蛋白比較,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點的24 h尿蛋白有差別(F=566.288,P=0.000)。②3組大鼠24 h尿蛋白有差別(F=6 679.977,P=0.000);模型組較對照組升高,活性維生素D3治療后24 h尿蛋白水平降低。③3組大鼠24 h尿蛋白變化趨勢有差別(F=843.349,P=0.000)。見表2和圖1。

    2.3 活性維生素D3對ADR腎病大鼠腎組織病理學(xué)改變的影響

    Masson染色結(jié)果顯示,對照組大鼠腎小球及腎小管基底膜的膠原成分被苯胺藍(lán)染成藍(lán)色,僅少量膠原分布,腎組織其他部分未見明顯膠原沉積。模型組大鼠的腎小球和腎小管基底膜增厚,腎間質(zhì)中染成藍(lán)色的膠原纖維增多,并出現(xiàn)片狀淡藍(lán)色纖維樣壞死。治療組大鼠腎間質(zhì)膠原纖維增生減輕,第10周末治療效果明顯,提示活性維生素D3能減輕腎小球結(jié)構(gòu)的損傷。見圖2。

    表1 3組大鼠24 h尿蛋白和血生化檢測結(jié)果比較(n=6,±s)

    表1 3組大鼠24 h尿蛋白和血生化檢測結(jié)果比較(n=6,±s)

    組別 24 h尿蛋白/mg TP/(g/L) ALB/(g/L) Scr/(μmol/L) TC/(mmol/L)對照組 7.353±0.370 63.273±3.951 33.530±1.922 26.855±0.761 1.603±0.226模型組 33.269±2.598 44.948±6.510 21.878±3.014 57.649±4.893 3.228±0.220 t值 5.562 5.390 3.935 6.307 1.027 P值 0.004 0.043 0.037 0.031 0.001

    表2 3組大鼠不同時間點的24 h尿蛋白比較(n=30,mg,±s)

    表2 3組大鼠不同時間點的24 h尿蛋白比較(n=30,mg,±s)

    組別 2周 4周 6周 8周 10周對照組 6.430±0.145 8.763±0.095 8.530±0.146 9.387±0.184 9.967±0.154模型組 33.233±0.963 39.390±0.224 42.983±0.845 66.063±0.723 79.163±0.563治療組 29.850±0.130 30.083±0.219 27.490±0.341 25.998±0.459 21.153±0.323

    圖1 3組大鼠24 h尿蛋白變化趨勢(n=30,±s)

    2.4 活性維生素D3對ADR腎病大鼠腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

    大鼠腎組織透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,對照組大鼠足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,基底膜平滑均勻無增厚,釘突狀足突清晰可見,向外延伸,彼此連接,細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則。模型組大鼠足細(xì)胞足突回縮,熔蠟般廣泛融合,細(xì)胞核畸形且胞內(nèi)有脂滴聚集。活性維生素D3治療后,足細(xì)胞損傷減輕,細(xì)胞核形態(tài)良好,足突完整,偶見融合與少量的脂滴凝集。見圖3。

    圖2 3組大鼠腎組織病理學(xué)改變(Masson染色×400)

    圖3 3組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)改變(透射電子顯微鏡)

    2.5 活性維生素D3對ADR腎病大鼠腎小球CD2AP分布的影響

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可以看出CD2AP主要定位于腎小球的足細(xì)胞胞漿內(nèi),呈黃褐色或淡黃色片狀分布。CD2AP蛋白在對照組、模型組、治療組的相對表達(dá)量分別為(0.094±0.002)、(0.041±0.014)和(0.080±0.019),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.802,P=0.000);治療組CD2AP蛋白表達(dá)水平高于模型組(P<0.05),可見活性維生素D3可抑制ADR誘導(dǎo)大鼠足細(xì)胞CD2AP表達(dá)降低,上調(diào)腎足細(xì)胞CD2AP的表達(dá),伴隨尿蛋白減少。見 圖4。

    圖4 ADR腎病大鼠腎組織CD2AP蛋白的表達(dá)(IHC×400)

    2.6 活性維生素D3對ADR腎病大鼠腎小球CD2AP蛋白表達(dá)的影響

    對照組、模型組、治療組大鼠2、6和10周的腎小球CD2AP蛋白相對表達(dá)量比較,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點大鼠腎小球CD2AP蛋白表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=111.181,P=0.000)。②3組大鼠腎小球CD2AP蛋白表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4613.574,P=0.000),治療組高于對照組和模型組。③3組大鼠腎小球CD2AP蛋白表達(dá)水平變化趨勢比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=95.446,P=0.000)。見表3和 圖5。

    表3 3組大鼠不同時間點CD2AP蛋白表達(dá)水平比較(n=30,±s)

    表3 3組大鼠不同時間點CD2AP蛋白表達(dá)水平比較(n=30,±s)

    注:1)與對照組比較,P<0.05;2)與模型組比較,P<0.05

    組別 2周 6周 10周對照組 0.854±0.105 0.864±0.201 0.896±0.067模型組 0.352±0.1501) 0.336±0.1241) 0.306±0.0171)治療組 0.490±0.0911)2) 0.510±0.2281)2) 0.734±0.0831)2)

    圖5 3組大鼠CD2AP蛋白表達(dá)水平的變化趨勢(n=30,±s)

    3 討論

    腎小球疾病仍然是慢性和終末期腎病的主要原因。通過對動物模型的研究,學(xué)者對人類腎小球疾病的認(rèn)識取得了重大進(jìn)展[4]。絕大多數(shù)CKD為腎小球上皮細(xì)胞的疾病。在科研實驗中,嚙齒動物能更好地誘導(dǎo)疾病,以利于研究其進(jìn)展機制,確定潛在的目標(biāo)和治療方法[5]。本實驗根據(jù)文獻(xiàn)報道,通過一次性尾靜脈注射ADR 7.5 mg/kg獲得非糖尿病足細(xì)胞疾病的動物模型,即ADR腎病模型[6]。2周末檢測24 h蛋白尿、血生化指標(biāo)顯示,與對照組比較,模型組24 h尿蛋白升高,血清TP、ALB下降,Scr、TC升高;且2周末大鼠精神狀態(tài)欠佳,反射遲鈍,飲食量減少,提示模型復(fù)制成功。

    足細(xì)胞損傷,突變或丟失都是足細(xì)胞復(fù)雜結(jié)構(gòu)的物理改變,一旦足細(xì)胞足突扁平或抹失,腎小球的濾過屏障就不再完整,血管中的蛋白質(zhì)泄漏至尿液中,就產(chǎn)生了蛋白尿[7]。蛋白尿是腎功能障礙重要的臨床標(biāo)志。

    維生素D最活躍的代謝物是1,25-二羥維生素D,其是礦物體內(nèi)平衡的中樞調(diào)節(jié)劑,對骨骼健康和礦物代謝至關(guān)重要[8]。也有研究證實在結(jié)腸直腸癌中,活性維生素D3能夠抑制增殖,促進(jìn)結(jié)腸癌上皮分化[5]。目前,關(guān)于CKD的研究熱點是活性維生素D3如何減輕腎足細(xì)胞損傷,改善CKD的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn),在嘌呤霉素氨基核苷腎病、ADR腎病、糖尿病腎病模型鼠中普遍存在維生素D的缺乏,給予 活性維生素D3可以減輕腎組織損傷,顯著減少蛋白尿的產(chǎn)生[9-11],與本研究結(jié)果有高度一致性[9-11]。筆者用ADR誘導(dǎo)的CKD模型腎組織損傷嚴(yán)重,Masson染色可見大量藍(lán)染的膠原纖維增生,腎小管間質(zhì)內(nèi)可見腎小管擴張和腎間質(zhì)纖維化。但腎臟纖維化是否與CD2AP蛋白密切相關(guān),目前尚沒有報道。

    CD2AP是足細(xì)胞裂孔隔膜特異表達(dá)的蛋白,能維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性,CD2AP表達(dá)異常在蛋白尿的發(fā)生機制中發(fā)揮重要的作用。RUSSO等[12]研究發(fā)現(xiàn),CD2AP基因敲除的小鼠,腎小球上皮細(xì)胞足突缺陷產(chǎn)生蛋白尿,最終腎衰竭而死。本研究發(fā)現(xiàn),ADR腎病大鼠腎組織損傷嚴(yán)重,超微結(jié)構(gòu)顯示腎足細(xì)胞核畸形,足突融合,脂滴形成,CD2AP表達(dá)明顯降低,這表明CD2AP表達(dá)降低是引起腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷的重要原因,進(jìn)一步破環(huán)腎小球濾過屏障,導(dǎo)致濾過膜通透性增強,產(chǎn)生蛋白尿?;钚跃S生素D3治療后,CD2AP表達(dá)增強,大鼠24 h尿蛋白降低,腎組織纖維化癥狀減輕,足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示胞核規(guī)則,胞膜光滑無增厚,足突清晰可見。

    本研究通過復(fù)制ADR腎病模型,證明ADR能夠誘導(dǎo)腎小球損傷,包括腎小球結(jié)構(gòu)病理改變及足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞,這些損傷參與慢性腎病蛋白尿的產(chǎn)生過程?;钚跃S生素D3能夠上調(diào)CD2AP表達(dá),改善腎足細(xì)胞損傷,維持腎小球濾過膜的完整性,減少了蛋白尿的產(chǎn)生,發(fā)揮腎功能保護(hù)作用。近年來,眾多學(xué)者對足細(xì)胞病、蛋白尿的分子機制和信號通路研究多集中在足細(xì)胞特異分子Nephrin引導(dǎo)的信號通路,而CD2AP獨立于其他分子的功能研究相對較少[13]。本研究證明CD2AP在活性維生素D3治療慢性腎病,減少蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展機制中承擔(dān)重要的角色。目前,關(guān)于CD2AP的具體分子機制尚不完善,有待研究者多維度深入探討。

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